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篇1

1 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的研究歷史背景

免疫分析的發(fā)展伴隨著抗體制備技術(shù)的改進(jìn)而不斷提高。美國(guó)科學(xué)家Yalow等人首先將標(biāo)記技術(shù)引入免疫分析，他們首先用放射免疫分析法(RIA)進(jìn)行測(cè)定胰島素。由于這種試驗(yàn)方法限制了試劑的壽命，難以獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)由于存在同位素的使用，不僅會(huì)損害操作人員身體健康，也會(huì)帶來(lái)污物處理困難的問(wèn)題。為了找到更為合理的免疫分析法成為以后20年來(lái)研究的熱點(diǎn)。直到70年代末，國(guó)外有學(xué)者將免疫反應(yīng)與化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)相結(jié)合，這種集高靈敏度和高特異性的技術(shù)稱(chēng)之為化學(xué)發(fā)光免疫分析法，化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)優(yōu)勢(shì)比較明顯，主要有以下幾點(diǎn)：第一，靈敏度高，檢測(cè)限范圍更精準(zhǔn);第二，自動(dòng)化程度高，并且沒(méi)有放射性輻射危害;第三，發(fā)光標(biāo)記物穩(wěn)定，有效期長(zhǎng)，同時(shí)應(yīng)用范圍寬，對(duì)于分子大小不同的抗原、半抗原及抗體都可檢測(cè)。因此，化學(xué)發(fā)光免疫分析在臨床、衛(wèi)生、食品、環(huán)保和軍事等領(lǐng)域正被越來(lái)越多地用于激素、蛋白質(zhì)、腫瘤、毒物、病毒等成分檢測(cè)。

2 免疫分析基本原理

由免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)兩個(gè)關(guān)鍵部分組成了化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理，化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)主要氧化以及催化的作用于化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，產(chǎn)生一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體，在處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，發(fā)射出光子，然后通過(guò)測(cè)量?jī)x器測(cè)量光量子。通過(guò)標(biāo)記物與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系，進(jìn)而測(cè)出被測(cè)物質(zhì)含量。而免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)在抗原或抗體上直接標(biāo)記。

3 化學(xué)免疫分析分類(lèi)

化學(xué)發(fā)光免疫分析法主要以標(biāo)記法的不同來(lái)進(jìn)行分類(lèi)，目前習(xí)慣上將免疫分析法主要分為兩類(lèi)，第一主要是標(biāo)記免疫分析法，其次是酶免疫分析法，前者是以化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，后者是以酶標(biāo)記，以化學(xué)發(fā)光底物作為信號(hào)試劑來(lái)進(jìn)行發(fā)光，其原理是不相同的。除此之外，包括熒光免疫分析法以及電化學(xué)發(fā)光免疫分析法也是目前存在的化學(xué)免疫法分析方法。

3.1 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析

將化學(xué)發(fā)光劑如吖啶酯類(lèi)化合物，直接標(biāo)記在抗原上或抗體上，其基本原理是啟動(dòng)發(fā)光劑發(fā)光，快速閃爍。這種標(biāo)記物其化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、無(wú)須催化劑;夾心法用于大分子抗原，競(jìng)爭(zhēng)法主要用于檢測(cè)小分子抗原，另外本底低，非特異性結(jié)合相對(duì)較少光量不會(huì)因?yàn)榉肿哟笮《苡绊懀虼四茉黾屿`敏度，一般常用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)主要是通過(guò)啟動(dòng)發(fā)光試劑NaOH-H2O2作用而發(fā)光，其發(fā)光非常迅速，小分子物質(zhì)多采用競(jìng)爭(zhēng)法，夾心法主要用于大分子物質(zhì)。

3.2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

通過(guò)酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)，再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)劑的作用下發(fā)光，然后用發(fā)光測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。化學(xué)發(fā)光酶免疫分析酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，按照標(biāo)記免疫分析，應(yīng)屬酶免疫分析，其操作步驟與酶免分析完全相同。目前常用的標(biāo)記酶為堿性磷酸酶和辣根過(guò)氧化物酶，它們有各自的發(fā)光底物。化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法種類(lèi)大致有三種，首先是HRP標(biāo)記CLEIA，一般常用3-氨基鄰苯二甲酰肼作為底物，也即是魯米諾或者用其衍生物4-氨基鄰苯二甲酰肼也是可以的，這兩種都是重要的發(fā)光試劑。需要注意的是該底物需要在堿性緩沖溶液中進(jìn)行氧化反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)然這需要在過(guò)氧化物酶及活性氧存在的條件下進(jìn)行，中間體回到基態(tài)時(shí)就可以發(fā)光，此時(shí)的波長(zhǎng)一般在425nm。曾經(jīng)先前有人用該標(biāo)記底物標(biāo)記抗原或抗體，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)其發(fā)光強(qiáng)度多受靈敏度的影響。目前用過(guò)氧化物酶進(jìn)行標(biāo)記，其發(fā)光強(qiáng)度主要依賴(lài)酶免疫反應(yīng)中的酶的濃度大小;其次增強(qiáng)發(fā)光酶免疫分析也是化學(xué)發(fā)光酶免疫分析的一種，它主要是在將增強(qiáng)的發(fā)光劑加入到發(fā)光系統(tǒng)中，加強(qiáng)發(fā)光的信號(hào)強(qiáng)度，并且能夠保持長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性，在一定程度上提高了該分析方法的準(zhǔn)確性和靈敏度，便于多次測(cè)定。目前在一些現(xiàn)代化的設(shè)備上，還可以由計(jì)算機(jī)進(jìn)行精確控制操作，比如，往系統(tǒng)中加入發(fā)光試劑以及混合、溫育、洗滌等，甚至后期的數(shù)據(jù)處理，進(jìn)而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終完成患者血清樣品的分析并打印出結(jié)果;最后一種就是用ALP標(biāo)記的CLEIA，這種分析方法一般多用環(huán)-1，22-二氧乙烷衍生物作為發(fā)光底物，它的發(fā)光原理主要是其用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析底物而設(shè)計(jì)的分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)固，其中的芳香基作為發(fā)光基團(tuán)和酶作用，在發(fā)光試劑的作用下發(fā)光，該底物在堿性磷酸酶的作用下，磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個(gè)磷酸基，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)穩(wěn)定的中間體，然后中間體發(fā)生裂解會(huì)產(chǎn)生金剛烷酮和激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，這種常見(jiàn)底物是AMPPD，其作為磷酸酯酶的直接化學(xué)發(fā)光底物，多用來(lái)檢測(cè)堿性磷酸酯酶和一些配基的結(jié)合物。

4 應(yīng)用

4.1 激素、蛋白質(zhì)和腫瘤檢測(cè)

該系統(tǒng)使反應(yīng)物形成均相混懸液，順磁微粒作為固定相，增大反應(yīng)面積，加速免疫反應(yīng)，快速分離，自動(dòng)洗滌，減少酶和催化劑的使用，pH調(diào)整即可，避免了許多影響因素，廣泛應(yīng)用于甲狀腺功能、藥物檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物及心血管等項(xiàng)目。

4.2 病毒、毒物檢測(cè)

楊秀岑等用ABEI標(biāo)記兔抗大腸桿菌lgG，試樣溫育、離心、沉淀峰值用luminol-H2O2-NaOH 發(fā)光體系測(cè)定;章竹君等測(cè)定了糞樣中的輪狀病毒以HRP酶標(biāo)記;為研究TNT對(duì)人體的毒害作用提供方法，張麗民等以HRP標(biāo)記免疫測(cè)定了血清中4-氨基-2，6-二硝基甲苯，效果非常顯著。

4.3 其他方面的應(yīng)用

被越來(lái)越多地用于免疫測(cè)定中的HRP酶標(biāo)記生成核酸探針，主要采用兩種形式，一種是靶DNA雜交，將HRP直接標(biāo)記在探針上，同時(shí)增強(qiáng)的魯米諾試劑檢測(cè)加入分離后的雜交體。另外一種是將DNA探針標(biāo)記在生物素及地高辛上，然后與靶DNA雜交，再用HRP標(biāo)記的親和素和抗地高辛與分離后的雜交體結(jié)合，最后加入魯米諾試劑氧化發(fā)光。

篇2

【關(guān)鍵詞】 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù);基本原理;分類(lèi);應(yīng)用

近10多年來(lái),當(dāng)代生物技術(shù)的研究和應(yīng)用取得高速發(fā)展的同時(shí),也大大推動(dòng)了化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(CLIA))的更新?lián)Q代速度?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)是建立在放射免疫分析技術(shù)(RIA)理論的基礎(chǔ)上,以標(biāo)記發(fā)光劑為示蹤物信號(hào)建立起來(lái)的一種非放射標(biāo)記免疫分析法,具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分析速度快和容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn),特別是能在較短的時(shí)間內(nèi)得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果,因此深受檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)工作者和臨床醫(yī)師的好評(píng)。

1 化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的基本原理,化學(xué)發(fā)光免疫分析含有免疫分析和化學(xué)發(fā)光分析兩個(gè)系統(tǒng)[1]。免疫分析系統(tǒng)是將化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或酶作為標(biāo)記物,直接標(biāo)記在抗原或抗體上,經(jīng)過(guò)抗原與抗體反應(yīng)形成抗原-抗體免疫復(fù)合物?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是在免疫反應(yīng)結(jié)束后,加入氧化劑或酶的發(fā)光底物,化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)氧化劑的氧化后,形成一個(gè)處于激發(fā)態(tài)的中間體,會(huì)發(fā)射光子釋放能量以回到穩(wěn)定的基態(tài),發(fā)光強(qiáng)度可以利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器進(jìn)行檢測(cè)[2]。根據(jù)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測(cè)物的含量。

2 化學(xué)發(fā)光免疫分析的分類(lèi)

化學(xué)發(fā)光免疫分析根據(jù)應(yīng)用發(fā)光體系應(yīng)用于免疫分析中的方式不同可分為直接標(biāo)記發(fā)光物質(zhì)的免疫分析,酶催化化學(xué)發(fā)光免疫分析,電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)。直接標(biāo)記發(fā)光物質(zhì)的免疫分析,目前常見(jiàn)的標(biāo)記物主要為魯米諾類(lèi)和吖啶酯類(lèi)化學(xué)發(fā)光劑。

3 化學(xué)發(fā)光免疫分析的臨床應(yīng)用

CLIA已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,成為替代RIA的首選技術(shù)。Amersham公司針對(duì)AmerliteTM發(fā)光增強(qiáng)酶免疫分析系統(tǒng)研制出的試劑盒項(xiàng)目有甲狀腺功能檢測(cè)的促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、游離甲狀腺素,與性激素有關(guān)的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮,以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。Amersham公司雖然研制出這10余種試劑盒,但因操作不夠簡(jiǎn)便,檢測(cè)項(xiàng)目?jī)H限于蛋白質(zhì)類(lèi)大分子化合物,未能廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)。

美國(guó)Ciba Corning公司研制的ACS:180自動(dòng)CLIA系統(tǒng)能非常精確測(cè)量閃光。經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn),實(shí)現(xiàn)了ACS:180CLIA系統(tǒng)的全自動(dòng)化,推出全新產(chǎn)品"ADVIA系列"。現(xiàn)有檢測(cè)項(xiàng)目47項(xiàng),更多的項(xiàng)目還在開(kāi)發(fā)之中。主要有甲狀腺系統(tǒng)、性腺系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、腫瘤標(biāo)記物、心血管系統(tǒng)、血藥濃度及其他一些檢測(cè)項(xiàng)目。

經(jīng)過(guò)改良后,金剛烷衍生物在堿性磷酸酶作用下可發(fā)出高強(qiáng)度的輝光,光信號(hào)可持續(xù)1～2 h。隨后國(guó)外生產(chǎn)廠家研制出以堿性磷酸酶為標(biāo)記物的試劑盒,與之相匹配的有DPC的IMMULITE全自動(dòng)CLIA系統(tǒng)和Beckman的ACCESS全自動(dòng)微粒子CLIA系統(tǒng)。IMMULITE全自動(dòng)CLIA系統(tǒng)可檢測(cè)項(xiàng)目有心臟病、甲狀腺功能、性腺激素、傳染病、藥物、血清學(xué)、血液病、成癮藥物、糖尿病、過(guò)敏檢測(cè)和腫瘤標(biāo)志物。ACCESS全自動(dòng)微粒子CLIA系統(tǒng)主要可檢測(cè)甲狀腺功能、血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌激素、藥物、腫瘤因子、心血管系統(tǒng)和糖尿病等項(xiàng)目。

目前商品化的ECLIA分析系統(tǒng)只有Roche公司的ECLIA全自動(dòng)分析系統(tǒng)。主要特點(diǎn)是本底信號(hào)極微,特異性更高,最小檢出值可達(dá)1 pmol以下,操作十分簡(jiǎn)便快速,是CLIA優(yōu)點(diǎn)較為集中的完美分析技術(shù)。已提供試劑盒的項(xiàng)目有腫瘤標(biāo)志物、甲狀腺功能、內(nèi)分泌、傳染病、心肌標(biāo)志物和維生素類(lèi)等項(xiàng)目。

王陽(yáng)[3]運(yùn)用了電化學(xué)免疫分析技術(shù),檢測(cè)了3種腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(Carcinoem-bryonic Antigen,CEA)、細(xì)胞角蛋白l9片段(Cytokeratin 19fragments,CYFRA21,1)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)水平,對(duì)肺癌診斷有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。張忠英[4]等利用電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測(cè)尿CK19片段,結(jié)果顯示尿CK19檢測(cè)對(duì)膀胱癌等泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)具有敏感性高、無(wú)創(chuàng)傷性的優(yōu)點(diǎn),優(yōu)于血清CK19和尿細(xì)胞學(xué)檢查。動(dòng)態(tài)觀察尿CK19片段含量的變化可降低急性尿感患者的假陽(yáng)性率。王利娜[5]等應(yīng)用ECLIA測(cè)定和酶免疫測(cè)定(EIA)檢測(cè)乙肝標(biāo)志物。結(jié)果:應(yīng)用ECLIA方法檢測(cè)HBsAg精密度,最大批內(nèi)變異≤8.30%,最大日間變異≤15.33%,HBsAg靈敏度0.05 ng/ml,HBeAg靈敏度0.03NCU/ml。HBsAg檢測(cè)范圍0.01～7 000 COI。顯示ECLIA檢測(cè)HBsAg靈敏度高,重復(fù)性好,檢測(cè)范圍寬。檢測(cè)HBeAg靈敏度可能更高。李錦洲[6]等采用ECLIA法對(duì)卵巢癌、良性卵巢腫瘤及健康婦女血清CA125分別進(jìn)行測(cè)定,ECLIA用于第二代CA125(CA125-Ⅱ)測(cè)定,使CA125測(cè)定更加敏感恒定,每日之間差異較小。黃琛,湯漢紅等[7]在ECLIA法檢測(cè)與蛋白質(zhì)芯片法多腫瘤標(biāo)志物結(jié)果差異的研究中顯示:兩種方法有較好的相關(guān)性(P

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用已非常成熟,有取代放射免疫分析技術(shù)和酶聯(lián)免疫分析技術(shù)而成為診斷市場(chǎng)上的主流產(chǎn)品的趨勢(shì)。國(guó)外的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)系統(tǒng)價(jià)格昂貴,普及有一定的困難;國(guó)內(nèi)的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)系統(tǒng)雖然價(jià)格較國(guó)外產(chǎn)品便宜很多,但其檢測(cè)的靈敏度和可靠性,還有待進(jìn)一提高。研究者在如何提高免疫診斷的敏感性和特異性、發(fā)展新的分析體系和檢測(cè)技術(shù)便攜化等方面仍需要不斷努力。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 李美佳.當(dāng)代免疫學(xué)技術(shù)與應(yīng)用.北京:北京醫(yī)科大學(xué)國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1998:549-561.

[2] 翟艷,王卉.化學(xué)發(fā)光免疫分析及其進(jìn)展.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,25(4):619-621.

[3] 王陽(yáng).電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測(cè)3種腫瘤標(biāo)志物對(duì)肺癌的診斷意義.Chin J Lab Diagn,2006,10(3):294-296.

[4] 張忠英.電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測(cè)尿CK19片段的臨床應(yīng)用及其評(píng)價(jià).中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,28(1):50-53.

[5] 王利娜,姚智.電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測(cè)乙肝標(biāo)志物的應(yīng)用.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,14(1):48-50.

[6] 李錦洲,洪錫田,呂曉嫻.腫瘤標(biāo)志物CA125檢測(cè)在卵巢癌診斷中的價(jià)值.中國(guó)誤診學(xué)雜志,2005,5(8):1456-1457.

[7] 黃琛,湯漢紅,王敏民.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)與電化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)多腫瘤標(biāo)志物結(jié)果的評(píng)價(jià).天津醫(yī)藥,2008,36(12):942-944.

[8] 張瑞,賈良勇.電化學(xué)發(fā)光免疫分析法在HCG定量檢測(cè)中的應(yīng)用.延安大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2008,6(3):108-109.

[9] 田潤(rùn)華,鄭春喜,王士珍.電化學(xué)發(fā)光免疫分析與臨床應(yīng)用.齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2004,19(5):464-465.

[10] 周建光,楊梅.電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)與臨床應(yīng)用.醫(yī)療裝備,2010,23(5):23-24.

篇3

關(guān)鍵詞:游離前列腺特異抗原,磁微?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析法,腫瘤標(biāo)志物

Key words: prostate specific antigen,microbeads-based chemiluminescence immunoassay. Tumor marker

Gao wei

Kaifeng City Maternity Hospital

[Abstract]A sensitive chemiluminescence enzyme immunoassay based on magnetic micro-beads was established to detect the free prostate specific antigen (f-PSA) in human serum. One antigen was coated on the magnetic micro-beads and the other was labled with horseradish peroxidase(HRP), with the highly sensitive Luminol chemiluminescence reaction as the detection system. The linear range of this method for PSA was 0.02~50ng/ml with the limit detection of 0.02 ng. The intra-assay coefficients of variation is lower than 4.7% and the percent recovery was in the range of 90%~110%. F-PSA in 510 clinical samples were detected with this method. Compared with Roche chemiluminescence immunoassays, the correlation coefficient of 0.995 was obtained. The results demonstrated that this method is reliable and shows proposed potential application in the clinical analysis of f-PSA for prostate cancer diagnosis.

前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen, PSA)是人體前列腺上皮組織細(xì)胞分泌的一種分子量為30～33 kDa的單鏈糖蛋白分子[1～3]。前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)病人血清中PSA濃度升高;良性前列腺增生(Benign Prostate Hyperplasia, BPH)病人血清中,PSA濃度也會(huì)升高;隨著年齡的增加,血清中PSA濃度也有不同程度的升高,在4～10 ng/ml的濃度范圍就形成了診斷灰區(qū)[4~6]。PCa病人血清中f-PSA濃度水平與BPH病人以及正常人相比,明顯偏低,游離前列腺特異抗原百分率對(duì)PCa的特異性更高,可降低臨床檢驗(yàn)篩查的假陽(yáng)性率。建立特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高的新型f-PSA檢測(cè)試劑將會(huì)對(duì)前列腺相關(guān)疾病的檢測(cè)具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1.材料及方法

1.1試劑: PSA、fPSA單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Seradyn公司;辣根過(guò)氧化物酶、魯米諾購(gòu)自sigma公司;f-PSA化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)試劑盒購(gòu)自Roche公司。

1.2儀器:LUMO微孔板化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀、IWO型洗板機(jī)(鄭州安圖生物工程有限公司);羅氏ELESYS2010電化學(xué)發(fā)光儀。

1.3臨床樣本:臨床樣本由腫瘤醫(yī)院提供。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 方法學(xué)原理:選用一步反應(yīng)雙抗體夾心法檢測(cè)f-PSA抗原。磁微粒表面結(jié)合PSA單克隆抗體;加入待檢測(cè)校準(zhǔn)品、臨床血清和酶標(biāo)記抗體;溫浴反應(yīng)后形成固相抗體-抗原-酶結(jié)合抗體的復(fù)合物,通過(guò)洗滌分離游離的抗原和酶標(biāo)記抗體,加入發(fā)光底物,使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品的定量分析。

2.2 抗體包被磁微粒:將300mg磁微粒分散于2ml包被液(0.05Mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液)中,室溫下振蕩4h,用20ml封閉液(0.5%BSA,pH 7.5磷酸鹽緩沖液)封閉4h,最終使用封閉保存液調(diào)整磁微粒濃度30mg/ml,密封置于冰箱2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2HRP抗體酶結(jié)合物的制備:采用改良過(guò)碘酸鈉法完成HRP對(duì)f-PSA單克隆抗體的標(biāo)記,酶結(jié)合物保持單克隆抗體的免疫反應(yīng)活性和酶的催化活性。

2.3f-PSA校準(zhǔn)品的配制:校準(zhǔn)品經(jīng)由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定,分裝,冷凍保存。

2.4血清f-PSA的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法:向微孔板中每孔加入校準(zhǔn)品或樣品50μL,磁微粒50μL,酶結(jié)合物溶液100μL,37℃溫育30min,使用磁分離洗滌設(shè)備洗滌4次,加入發(fā)光底物100μL,室溫避光反應(yīng)5 min,測(cè)量相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度單位(RLU),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)血清中f-PSA實(shí)現(xiàn)定量分析。

3.結(jié)果分析

3.1 包被濃度的影響:比較不同的包被濃度(1.0、2.0、3.0和5.0 ug/ml)對(duì)體系的影響。隨著包被濃度的提高,校準(zhǔn)品信號(hào)值升高,濃度達(dá)到3ug/ml后,校準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)發(fā)光值開(kāi)始下降,認(rèn)為3ug/ml的包被濃度已經(jīng)達(dá)到飽和。

3.2酶結(jié)合物濃溶優(yōu)選:將酶結(jié)合物分別以1∶1000、1∶2000、1∶3000進(jìn)行稀釋,比較不同分析結(jié)果的影響。結(jié)果表明,在1∶2000稀釋比條件下,校準(zhǔn)品信號(hào)值、靈敏度、線性、HOOK值檢出均達(dá)到最佳。

3.3溫育時(shí)間:考察了不同溫育時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響,溫育時(shí)間超過(guò)30min后,校準(zhǔn)品信號(hào)值不再升高,表明免疫反應(yīng)達(dá)到飽和,最終確定溫浴時(shí)間為30min。

3.4溫浴條件:考察了三種不同的溫育方式,即4度、室溫和37℃對(duì)反應(yīng)體系的影響。37度時(shí)RLU較室溫反應(yīng)提高57%,同時(shí)考慮37℃恒溫溫育的條件更容易控制,選擇37℃恒溫溫育作為溫育條件。

3.5 性能評(píng)價(jià)

根據(jù)國(guó)家相關(guān)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)建立的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光f-PSA進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果如下:

臨床考核研究選用本院電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑為對(duì)照組。自2009年7月以來(lái),收集經(jīng)病理中心確診前列腺患者血清樣本43份、前列腺炎患者血清樣本142份,隨機(jī)收集正常男性血清樣本325份。血清按照檢測(cè)試劑盒要求采集的非抗凝血清,樣本需清亮不混濁、樣本量不少于300μl。采集后2~8 ºC冷藏,如1天內(nèi)不檢測(cè),則應(yīng)冷凍(-20ºC)保存,不得反復(fù)凍融。其測(cè)定值相關(guān)性及相關(guān)系數(shù)分別為:Y(磁發(fā)光) = 1.0075x (Roche)+ 0.0386R= 0.9953

4 討論

本方法為化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫系統(tǒng)與磁性微粒分離技術(shù)相結(jié)合的一種測(cè)定方法,它使雙抗體夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)在游離標(biāo)記抗體和抗原復(fù)合物中具有分離完全和快速的優(yōu)點(diǎn)。建立的f-PSA檢測(cè)方法重復(fù)性良好,線性范圍寬,具有較高的精密性和準(zhǔn)確度,特異性強(qiáng)。經(jīng)過(guò)對(duì)510份臨床血清研究表明與電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)結(jié)果符合程度達(dá)到0.99以上。

此方法操作簡(jiǎn)便、快捷,全部測(cè)定時(shí)間僅需40分鐘,顯著提高工作效率,滿足醫(yī)生及病人即刻出結(jié)果的要求。

參考文獻(xiàn):

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2.Djavan B , Zlotta A , Kratzik C , et al . PSA , PAS density , PSA density of transition zone , free/ total PSA ratio , and PSA velocity for early detection of prostate cancer in men with serum PSA 2. 5 to 4. 0ng/ ml . Urology 1999 Sep ;54(3) :517

3.張靈, 計(jì)國(guó)義, 李曉萌等. fPSA/ tPSA比值優(yōu)化前列腺癌早期診斷作用的研究[J],中華男科學(xué)雜志,2004,8(10):582-585

篇4

2月-2016年2月筆者所在醫(yī)院門(mén)診婦科收治的疑似梅毒患者200例為試驗(yàn)對(duì)象。所有患者均取晨起空腹靜脈血檢測(cè)，初篩試驗(yàn)采用CLIA法展開(kāi)特異性梅毒螺旋體抗體試驗(yàn)，再將標(biāo)本經(jīng)TPPA與梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）進(jìn)行復(fù)檢。比較不同S/CO值標(biāo)本TPPA與TRUST復(fù)檢結(jié)果。結(jié)果：S/CO值12.00標(biāo)本符合率分別為91.30%、94.87%、97.14%、96.43%、100%，均明顯高于TRUST的63.04%、69.23%、68.57%、75.00%、77.78%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

【關(guān)鍵詞】 化學(xué)發(fā)光免疫分析法； 梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)； 梅毒； 血清學(xué)篩查

doi：10.14033/ki.cfmr.2017.15.023 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2017）15-0042-02

梅毒是一種傳染性較強(qiáng)、病程較長(zhǎng)的性傳播疾病，可嚴(yán)重?fù)p害心血管、神經(jīng)等多系統(tǒng)，對(duì)人們健康危害極大，尤其威脅臨床輸血安全[1]。此外，梅毒可通過(guò)母嬰傳播這一途徑將梅毒傳染至胎兒，進(jìn)而造成先天梅毒、自發(fā)性流產(chǎn)。故早期診治梅毒顯得尤為重要。目前臨床常用的檢測(cè)方式為血清學(xué)篩查，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）、CLIA、TPPA、TRUST等。其中ELISA、CLIA、TPPA屬于特異性梅毒抗體試驗(yàn)，而TRUST屬于非特異性梅毒抗體試驗(yàn)[2]。多數(shù)醫(yī)院采用上述其中的兩種方式篩查梅毒，但因選用不同的方式可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生差異。本研究擬用CLIA法聯(lián)合TPPA法進(jìn)行梅毒血清學(xué)篩查，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值，為梅毒早期診斷提供合理借鑒，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年2月-2016年2月筆者所在醫(yī)院門(mén)診婦科收治的疑似梅毒患者200例為試驗(yàn)對(duì)象，年齡23～70歲，平均（36.84±3.26）歲。

1.2 儀器與設(shè)備

微量U形反應(yīng)板、平板混合器、微量滴管（25 μl/滴）、微量加樣器（25 μl）。CLIA法采用Chem cline全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，應(yīng)用北京科美生物技術(shù)有限公司提供的配套試劑盒。TPPA試劑盒由日本富士瑞必歐株式會(huì)社提供，包括血清稀釋液、陽(yáng)性對(duì)照血清、致敏粒子、溶解液等。TRUST試劑購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

1.3 方法

所有患者均取3 ml晨起空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血，行離心處理15 min，轉(zhuǎn)速為3000 r/min，血清分離后，制作血清標(biāo)本，于4 ℃保存。采用全自動(dòng)分析儀進(jìn)行CLIA測(cè)試，并讀取結(jié)果。參照實(shí)際說(shuō)明書(shū)，S為待測(cè)樣品發(fā)光值，陰性對(duì)照品平均發(fā)光值的2.1倍為臨界值（CO）。S/CO

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用字2檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

S/CO值12.00標(biāo)本符合率均明顯高于TRUST，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

3 討論

梅毒是由蒼白密螺旋體感染導(dǎo)致的性傳播疾病，其病原體可累及全身所有臟器，引起多器官病變、破壞組織，從而導(dǎo)致功能失常。近年來(lái)，隨著人們行為觀念及生活方式的變化，梅毒發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，逐漸引起臨床重點(diǎn)關(guān)注[3]。由于梅毒螺旋體僅存在于人體內(nèi)，故人是唯一的梅毒傳染源。文獻(xiàn)[4]顯示，95%～98%左右的患者是通過(guò)性接觸而感染，梅毒螺旋體通過(guò)穿透人體正常皮膚及黏膜，從而使健康者感染梅毒?；颊呷旧厦范竞笃湫难芟到y(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重受損，生命安全受到威脅，同時(shí)該病具有較強(qiáng)的傳染性，因而積極防治梅毒對(duì)維護(hù)社會(huì)公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

傳統(tǒng)上梅毒篩查方式主要有兩種，一是初篩以特異性梅毒螺旋體試驗(yàn)，復(fù)檢應(yīng)用非特異性梅毒螺旋體試驗(yàn)；另外一種方式中初篩與復(fù)檢分別應(yīng)用非特異性與特異性梅毒螺旋體試驗(yàn)。在梅毒血清學(xué)篩查中，較高的敏感度是對(duì)檢查方式的重點(diǎn)要求，目前，CLIA是梅毒初篩試驗(yàn)中應(yīng)用較為普遍的一種方式，制備梅毒螺旋體抗原，并以辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行標(biāo)記，與標(biāo)本中抗體形成雙抗原夾心后，洗滌添加化學(xué)發(fā)光底物，發(fā)光強(qiáng)度測(cè)定后，依據(jù)S/CO值判斷標(biāo)本有無(wú)梅毒螺旋體特異性抗體[5]。由于整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中采用全自動(dòng)分析儀讀取結(jié)果，從而充分發(fā)揮高自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)，減少認(rèn)為誤差，并避免攜帶污染。故該檢測(cè)方法能夠?qū)Υ笈繕?biāo)本進(jìn)行篩查。但因其敏感度較高，在檢測(cè)低S/CO值標(biāo)本時(shí)易發(fā)生假陽(yáng)性現(xiàn)象，進(jìn)而造成誤診，增加臨床確診難度[6]。本研究中，46例S/CO值為1.00～2.99患者中，經(jīng)TPPA確證為陰性4例，而TRUST復(fù)檢出17例陰性。該標(biāo)本多來(lái)自腫瘤或透析患者，因此，針對(duì)S/CO值較低的患者需謹(jǐn)慎處理，并采用TPPA進(jìn)行確證，減少假陽(yáng)性的存在。另外，在CLIA初篩后，TPPA復(fù)檢符合率為96.00%，明顯高于TRUST的74.50%，表明TPPA聯(lián)合CLIA檢測(cè)梅毒可有效提高檢測(cè)準(zhǔn)確度，減少漏診、誤診現(xiàn)象。這是由于TPPA采用人工載體明膠粒子與梅毒螺旋體抗體形成凝集，發(fā)生粒子凝聚反應(yīng)，進(jìn)而有效檢測(cè)出血清中梅毒螺旋體抗體，其靈敏度與特異度均具有較高水平。而本研究中CLIA檢出率高于TPPA，可能是由藥物干擾所致，或是梅毒螺旋體隱性感染。TRUST作為非特異性梅毒螺旋w，可通過(guò)觀察滴度的變化，以判斷梅毒感染情況。但在復(fù)檢試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性率偏低，存在漏診率高等問(wèn)題。故本研究認(rèn)為，CLIA聯(lián)合TPPA檢測(cè)梅毒更具臨床應(yīng)用價(jià)值。但需注意的是，TPPA法在實(shí)際操作過(guò)程中存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁雜、自動(dòng)化水平低等問(wèn)題，判讀結(jié)果時(shí)易受人為因素影響，尤其是標(biāo)本介于陽(yáng)性與陰性之間，難免出現(xiàn)誤差[7]。而CLIA能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、高自動(dòng)化、重復(fù)性檢測(cè)，客觀的判讀結(jié)果，敏感度更高，故更適合應(yīng)用于初篩試驗(yàn)[8]。由于各檢測(cè)方式均存在一定的漏診、誤診現(xiàn)象，臨床實(shí)際篩查中應(yīng)注重采用聯(lián)合的方式進(jìn)行檢測(cè)，尤其是對(duì)于S/CO值較低的標(biāo)本，經(jīng)CLIA法初篩后，應(yīng)給予TPPA法確證，以確保檢測(cè)準(zhǔn)確度，盡可能的減少誤診、漏診現(xiàn)象，從而避免醫(yī)療糾紛，構(gòu)建和諧的醫(yī)患關(guān)系。

綜上所述，CLIA聯(lián)合TPPA法在梅毒血清學(xué)篩查中具有顯著的應(yīng)用價(jià)值，臨床可充分發(fā)揮CLIA敏感度高的優(yōu)勢(shì)，在初篩后應(yīng)用TPPA法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確證，提高診斷準(zhǔn)確度，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[2]鄧勁，饒郴麗，楊廷富，等.化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)梅毒螺旋抗體的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，36（8）：1041-1042.

[3]呂松琴，趙華，寶福凱，等.ECLIA法與ELISA法在梅毒診斷中的臨床價(jià)值的對(duì)比[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，37（4）：124-127.

[4]牛奇山，張柏梁.明膠顆粒凝集試驗(yàn)與微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)梅毒螺旋體[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，35（4）：493-494.

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[6]夏芳，徐元宏，汪學(xué)龍.梅毒螺旋體抗體血清學(xué)檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用價(jià)值探討[J].中華流行病學(xué)雜志，2016，37（6）：863-867.

篇5

關(guān)鍵詞：乙肝血清標(biāo)志物；化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)；性能評(píng)價(jià)

乙型肝炎（hepatitis B）是由HBV感染引起的傳染病，世界范圍內(nèi)均有流行，我國(guó)則是乙型肝炎病毒感染的高發(fā)區(qū)[1]，所有乙肝患者中有15%～25%將死于慢性肝病（肝癌，肝硬化），因此，HBV感染是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。及時(shí)準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷方法對(duì)效控制HBV傳播顯得尤為重要。隨著對(duì)乙肝研究的深入和新的抗病毒藥物的問(wèn)世，僅僅定性檢測(cè)己經(jīng)滿足不了臨床需求。近年來(lái)，隨著定量免疫檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)的完善和新的檢測(cè)技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)的發(fā)展和成熟[2，4]，乙型肝炎定量檢測(cè)己經(jīng)成為不少實(shí)驗(yàn)室的選擇。隨著實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化建設(shè)的發(fā)展以及對(duì)檢驗(yàn)質(zhì)量的追求，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng)的性能評(píng)價(jià)己經(jīng)越來(lái)越受到人們重視。我們對(duì)本科室目前新投入使用的LIAISON XL化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)及配套乙肝兩對(duì)半檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了初步性能評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料 索林LIAISON XL化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，乙肝兩對(duì)半檢測(cè)試劑盒及配套校準(zhǔn)品，上海市臨床檢驗(yàn)中心提供的室內(nèi)質(zhì)控物（批號(hào)1401）。

1.2標(biāo)本來(lái)源 本院門(mén)診及住院患者血清以及各項(xiàng)目臨床異常高值標(biāo)本。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)及校準(zhǔn)，連續(xù)觀察儀器運(yùn)行狀態(tài)一周，運(yùn)行穩(wěn)定且狀態(tài)良好，熟悉儀器操作及實(shí)驗(yàn)步驟后進(jìn)行各項(xiàng)性能評(píng)價(jià)。所有實(shí)驗(yàn)運(yùn)行均在儀器狀態(tài)良好，質(zhì)控在控前提下進(jìn)行。

1.3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 批內(nèi)及批間不精密度 依據(jù)NCCLS-EP15A文件，將患者混合血清分別分裝5管放置于-20℃冷凍保存，每天解凍1管上機(jī)重復(fù)檢測(cè)4次，連續(xù)5d。

1.3.2.2 線性評(píng)價(jià) 按照NCCLS-EP6要求：各選取一份高值（H）和低值（L）患者標(biāo)本（必須接近檢測(cè)高限和低限），用于線性范圍參數(shù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。樣本分別按H、4H+L、3H+2L、2H+3L、H+4L、L的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度重復(fù)測(cè)定2次，計(jì)算均值。

1.3.2.3分析靈敏度 使用接近檢測(cè)下限的患者標(biāo)本， 將樣本上機(jī)后連續(xù)檢測(cè)20次，計(jì)算該濃度下光信號(hào)的檢測(cè)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)平均值（mean）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）、變異系數(shù)（CV）。變異在20%內(nèi)為可接受。

1.3.2.4符合率 按照NCCLS-EP12-A2文件要求，HBeAb、HBcAb的檢測(cè)結(jié)果是以index的形式表達(dá)定性結(jié)果，符合率采用陰陽(yáng)性樣品各50份與原先使用的LIAISON發(fā)光分析儀檢測(cè)結(jié)果做比對(duì)。

1.3.2.5數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均使用Microsoft office Excel 2003軟件處理。

2結(jié)果

2.1批內(nèi)及批間不精密度評(píng)價(jià) 見(jiàn)表1所示，本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)乙肝標(biāo)志物所得CV均在廠家聲明的范圍之內(nèi)，為可接受水平。

2.2 LIAISON X檢測(cè)乙肝標(biāo)志物線性評(píng)價(jià) 將實(shí)測(cè)值與理論值作比較，計(jì)算 y=bx+a，驗(yàn)證線性范圍。斜率b值在1±0.05范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r≥0.975即線性符合要求。HBsAg線性測(cè)試結(jié)果分別見(jiàn)表2及圖1所示。用相同方法分別驗(yàn)證HBsAb、 HBeAg、HBeAb、HBcAb檢測(cè)線性結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3分析靈敏度驗(yàn)證 廠家提供的HBsAg、HBsAb 、HBeAg的檢出下限分別為 0.03IU/ml、5 mlU/ml、0.01PEIU/ml。采用接近檢出下限的患者標(biāo)本，連續(xù)檢測(cè)20次，得到該濃度下光信號(hào)的檢測(cè)數(shù)據(jù)，平均值（mean）分別為716.9、545.05、402.45；標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD） 分別為72.2123、94.5696、52.1864；變異系數(shù)（CV） 分別為10.07%、17.35%、12.97%，變異系數(shù)均在20%以下，為可接受范圍。

2.4符合率 用患者血清樣本對(duì)兩測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)， HBeAb、HBcAb的檢測(cè)結(jié)果是以index的形式表達(dá)定性結(jié)果，符合率采用陰陽(yáng)性樣品各50份與原先使用的LIAISON發(fā)光分析儀檢測(cè)結(jié)果做比對(duì)。兩種測(cè)試結(jié)果完全相同，符合率100%，即敏感性和特異性均為100%，敏感性差值（D）=0%；特異性差值（D）=0%。兩個(gè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果有很好地一致性（Kappa值=1）。

3討論

HBV血清標(biāo)志物的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫分析法（EIA）、放射免疫分析法（RIA）、微球酶免分析法（MEIA）、以及化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法極大地改善了HBV標(biāo)志物檢測(cè)的靈敏度和特異性。然而，由于免疫分析方法難以標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)致不同免疫分析系統(tǒng)測(cè)定結(jié)果之間存在差異，因此為保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，對(duì)全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行客觀的性能評(píng)估非常重要[3-5]。

檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性對(duì)乙肝標(biāo)志物檢測(cè)非常重要，可用精密度來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)果的重復(fù)性。本文依據(jù)NCCLS-EP15A文件[6]，將患者混合血清分別分裝5管放置于-20℃冷凍保存，每天解凍1管上機(jī)重復(fù)檢測(cè)4次，連續(xù)5d。結(jié)果表明LIAISON XL化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行乙肝兩對(duì)半檢測(cè)時(shí)很好的重復(fù)性，，批內(nèi)不精密度CV在 1.56～3.07%，總不精密度在2.64～5.44%。

檢測(cè)患者標(biāo)本時(shí)，當(dāng)標(biāo)本中乙肝標(biāo)志物濃度在檢測(cè)系統(tǒng)的線性范圍時(shí)，檢測(cè)結(jié)果更接近于被測(cè)物的真值，此謂檢測(cè)結(jié)果的可靠性。對(duì)于LIAISON XL檢測(cè)乙肝標(biāo)志物的線性范圍，未見(jiàn)有文獻(xiàn)進(jìn)行相關(guān)評(píng)價(jià)，廠家提供的申明認(rèn)為線性斜率b值在1±0.05范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r≥0.975即線性符合要求。本驗(yàn)證試驗(yàn)所得HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、HBeAb、HBcAb均有良好的線性范圍（斜率b在0.9608～1.0190 之間， r2 為0.9963～0.9998），能夠確保高值樣在稀釋的條件下，得到較高可信度的檢測(cè)結(jié)果。使用接近檢測(cè)下限的患者標(biāo)本， 將樣本上機(jī)后連續(xù)檢測(cè)20次，得到該濃度下光信號(hào)的檢測(cè)數(shù)據(jù)，計(jì)算變異系數(shù)（CV）均在20%以下，表明該檢測(cè)系統(tǒng)的分析靈敏度符合廠家的申明。

目前，國(guó)內(nèi)乙肝標(biāo)志物的檢測(cè)主要采用ELISA法和各種化學(xué)發(fā)光法。檢測(cè)試劑、儀器、操作人員等的差異，同一檢測(cè)標(biāo)本在不同實(shí)驗(yàn)室、不同檢測(cè)方法、不同檢測(cè)系統(tǒng)之間檢測(cè)結(jié)果的一致性難以得到保證。LIAISON XL化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)是LIAISON升級(jí)版，反應(yīng)倉(cāng)位增加，加樣的獨(dú)立性及一次性使用的吸樣頭避免了交叉污染的可能。按照NCCLS-EP12-A2文件要求[7]，HBeAb、HBcAb的檢測(cè)結(jié)果是以index的形式表達(dá)定性結(jié)果，本研究采用陰陽(yáng)性樣品各50份與原先使用的LIAISON發(fā)光分析儀檢測(cè)結(jié)果作比對(duì)，計(jì)算符合率，兩者測(cè)試結(jié)果完全相同，符合率100%，確保了檢測(cè)結(jié)果的一致性。

隨著實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化建設(shè)的發(fā)展以及對(duì)檢驗(yàn)質(zhì)量的追求，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng)的性能評(píng)價(jià)己經(jīng)越來(lái)越受到人們重視。綜合本研究對(duì)LIAISON XL化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)乙肝標(biāo)志物HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、HBeAb、HBcAb精密度、線性范圍、符合率、分析靈敏度等的系統(tǒng)評(píng)價(jià)，表明該系統(tǒng)測(cè)定樣本快速，各方面性能良好，能適應(yīng)醫(yī)院臨床樣本的檢測(cè)需要。

參考文獻(xiàn)：

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篇6

[關(guān)鍵詞] 梅毒；作用；化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）02（b）-0010-03

梅毒是感染梅毒螺旋體后引起的一種易傳染的性傳播疾病[1]。梅毒是一種易傳染、危害性大的人類(lèi)性傳播疾病[2-4]。血清學(xué)檢測(cè)梅毒螺旋體抗體的方法已經(jīng)被我國(guó)衛(wèi)生部列為手術(shù)前、孕婦產(chǎn)前的必檢項(xiàng)目，血清學(xué)檢測(cè)梅毒螺旋體抗體的方法是診斷梅毒的重要依據(jù)之一[5-6]。因此，選擇特異性強(qiáng)、敏感性高的實(shí)驗(yàn)方法非常有助于梅毒的診治。為探討化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法在梅毒螺旋體抗體檢測(cè)中所起的作用，該研究選擇該院臨床中心2012―2013年收治的160例梅毒患者為研究對(duì)象，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇該院臨床中心的160例梅毒患者血清與135例非梅毒患者的血清為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，梅毒患者血清標(biāo)本通過(guò)真空促凝管采集靜血漿3 mL，將血清分離，保存在4～8 ℃的冰箱，待檢測(cè)[7-9]。

1.2 儀器與試劑

CLIA試劑盒、TPPA試劑盒均為日本富士瑞必歐生物技術(shù)有限公司，RPR試劑盒為上海榮盛生物科技有限公司。

1.3 方法

將160份梅毒患者血清與135例非梅毒患者血清標(biāo)本分別同時(shí)進(jìn)行CLIA和TPPA檢測(cè)，比較兩種方法的不同之處。

將160份梅毒患者血清與135例非梅毒患者血清，進(jìn)行CLIA檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性時(shí)，再進(jìn)行TPPA和RPR檢測(cè)，探討TPPA陽(yáng)性結(jié)果的S/CO值與TPPA、RPR之間有何聯(lián)系。所有進(jìn)行檢測(cè)的試劑均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，且操作均按照操作說(shuō)明書(shū)操作[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS14.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

①160份梅毒患者血清中，CLIA法檢測(cè)陽(yáng)性151份，TPPA陽(yáng)性130份，以回歸分析結(jié)果為參考，CLIA法的陽(yáng)性率為93.75%，TPPA法的陽(yáng)性率為82.50%，兩種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.8，P

②135份非梅毒患者血清中，CLIA法檢測(cè)陽(yáng)性率為2.28%，TPPA法檢測(cè)陽(yáng)性率為9.28%，RPR陽(yáng)性法檢測(cè)陽(yáng)性率為10.37%。CLIA的S/CO值在2～11有3份，其中TTPA陽(yáng)性12份，RPR陽(yáng)性14份；7

③CLIA與TPPA結(jié)果不一致的21份，經(jīng)RPR法檢測(cè)，陽(yáng)性4份，1份含TP31、TP47條帶，3份含TP32、TP47條帶，1份 含TP17、TP32、TP47條 帶，檢測(cè)結(jié)果未顯示出的4份，為T(mén)P45陽(yáng)性。14份RPR法檢測(cè)陰性的標(biāo)本，通過(guò)CLIA法驗(yàn)證也均為陰性 [11]。

3 討論

梅毒對(duì)人體的危害多種多樣，越早對(duì)梅毒的確診，有利于患者得到全面有效的治療，有利于患者疾病的快速康復(fù)。梅毒臨床確診按照梅毒病毒的特異性抗體的檢測(cè)和患者的臨床癥狀作為判斷依據(jù)[12]。TP-ELISA適合數(shù)量較大的操作，但測(cè)量結(jié)果經(jīng)常遇到假陽(yáng)性的情況[13]。CLIA技術(shù)是ELISA技術(shù)的更新技術(shù)，以敏感的化學(xué)發(fā)光底物代替原始的底物，其特點(diǎn)是信號(hào)模式可被酶增強(qiáng)，而且發(fā)光信號(hào)時(shí)間被保持和拉長(zhǎng)了，一方面保留了發(fā)光免疫分析超高的敏感性，另一方面也避免了傳統(tǒng)光信號(hào)持續(xù)時(shí)間較短等缺點(diǎn)。過(guò)氧化物酶催化魯米諾發(fā)光和堿性磷酸酶催化金剛烷衍生物的方法是當(dāng)今較為常用的兩種方法。CLIA法對(duì)各期梅毒的靈敏性和特異性均>97.5%，因此其也成為一種新興的檢測(cè)梅毒的方法[14]。

該研究發(fā)現(xiàn)， CLIA法的陽(yáng)性符合率高于TPPA法。研究發(fā)現(xiàn)，CLIA法為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，S/CO值較低時(shí)TPPA會(huì)出現(xiàn)陰性結(jié)果， RPR法發(fā)現(xiàn)14份為陰性，CLIA法驗(yàn)證結(jié)果也為陰性，由此可說(shuō)明CLIA法的靈敏度明顯高于TPPA法；此外，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果可能是標(biāo)本處理不當(dāng)導(dǎo)致的。

采用RPR法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的為4份，1份為T(mén)P17、TP45條帶，2份為T(mén)P45、TP47條帶，1份為T(mén)P32、TP45、TP47條帶。這是由于CLIA包被的梅毒抗原特異性導(dǎo)致的，而TPPA采用的抗原是提純后的致病性梅毒螺旋體菌體，對(duì)TP15、TP17、的抗體選擇性較強(qiáng)，當(dāng)僅有TP15、TP17抗體時(shí)，TPPA只會(huì)出現(xiàn)陰性。有研究發(fā)現(xiàn)梅毒早期診斷的指標(biāo)之一為T(mén)P47 [15]，活動(dòng)期梅毒標(biāo)志的抗體之一是TP15 [16]。因此推測(cè)，9份抗體梅毒標(biāo)本可能屬于早期感染或隱性感染的患者，在早期或隱性梅毒感染中的檢測(cè)CLIA法比TPPA具有更高的靈敏度。

綜上，CLIA作為一種新開(kāi)發(fā)的梅毒抗體檢測(cè)試劑，相比TPPA具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)，且容易操作、自動(dòng)化技術(shù)高、結(jié)果判斷準(zhǔn)確且重復(fù)性較好等優(yōu)勢(shì)，有望成為臨床上廣泛使用的一種方法。

[參考文獻(xiàn)]

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篇7

【關(guān)鍵詞】 ARCHITECT—i2000SR；梅毒螺旋體特異性抗體；性能評(píng)價(jià)

i2000SR運(yùn)用的是化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法，它能對(duì)多項(xiàng)免疫項(xiàng)目進(jìn)行定性或定量分析。由于在不同的運(yùn)行環(huán)境下相同儀器有可能出現(xiàn)性能差異，本科新儀器投入臨床使用前要對(duì)該儀器檢測(cè)系統(tǒng)中的進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。

1 材 料

1.1 儀器 ARCHITECT—i2000SR全自動(dòng)免疫分析儀。

1.2 試劑 原裝配套試劑盒。

1.3 標(biāo)本 2012年本院的住院或健康體檢者。

2 方 法

2.1 空白實(shí)驗(yàn) 使用PBS作為樣本測(cè)定三次，記錄結(jié)果。

2.2 精密度 ①日間精密度：使用高、中、低質(zhì)控品連續(xù)測(cè)定15天，計(jì)算CV值。②批內(nèi)精密度：使用高、中、低3個(gè)水平的血清重復(fù)測(cè)定15次，計(jì)算CV值。

2.3 線性范圍 收集略高于線性范圍下限的低值血清（L）和略低于線性范圍上限的高值血清（H），按5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L、5L梯度進(jìn)行混合并檢測(cè)1，對(duì)不同濃度的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行線性回歸分析。

2.4 污染攜帶率 先取一份H值標(biāo)本，連續(xù)測(cè)定3次，隨后立即取一份L值標(biāo)本連續(xù)測(cè)定3次：攜帶污染率=（L1—L3）/（H3—L3）×100%。

2.5 參考區(qū)間驗(yàn)證 按照NCCLS2推薦的要求進(jìn)行驗(yàn)證，選擇經(jīng)體檢排除其他疾病的正常血清標(biāo)本男女性標(biāo)本各20名，觀察檢測(cè)結(jié)果是否在參考范圍內(nèi)。

3 結(jié) 果

3.1 精密度試驗(yàn)結(jié)果 高、中、低3個(gè)水平血清的批內(nèi)精密度CV分別為5.54%、7.04%和3.54%，用廠家配套低、高水平質(zhì)控品測(cè)定結(jié)果的批間精密度CV分別為8.92%及6.69%，均小于10%。

3.2 空白試驗(yàn)結(jié)果 PBS三次結(jié)果分別為0.01、0.02和0.01。

3.3 線性試驗(yàn)結(jié)果 Y=0.9963X+0.0029，相關(guān)系數(shù)R2=0.9965。由結(jié)果可知，儀器的線性良好，達(dá)到說(shuō)明書(shū)的要求。

3.4 攜帶污染率 攜帶污染率為0.29%

3.5 參考區(qū)間驗(yàn)證 經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，檢測(cè)值均落在廠家給定的參考范圍之內(nèi)，符合率為100%。

4 討 論

近年來(lái)全自動(dòng)免疫化學(xué)發(fā)光儀在梅毒特異性抗體定量檢測(cè)中的應(yīng)用逐漸受到重視，i2000SR采用微粒子化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)定量測(cè)定梅毒特異性抗體。為保證檢驗(yàn)質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)室對(duì)新裝的儀器在用于檢測(cè)臨床標(biāo)本前都應(yīng)該要做性能評(píng)價(jià)。通過(guò)性能評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，該儀器檢測(cè)梅毒螺旋體特異性抗體的空白試驗(yàn)良好；批內(nèi)精密度和日間精密度均小于10%，試驗(yàn)表明儀器測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，能滿足臨床應(yīng)用的要求；通過(guò)線性范圍的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)儀器在廠家給定的范圍內(nèi)線性良好、能滿足臨床要求；標(biāo)本的攜帶污染率低，證明該儀器的自動(dòng)沖洗管道能力強(qiáng)，能夠有效控制交叉污染3；對(duì)參考區(qū)間的驗(yàn)證結(jié)果都在儀器說(shuō)明書(shū)給出的參考范圍內(nèi)。

總之，通過(guò)對(duì)ARCHITECT—i2000SR全自動(dòng)免疫分析儀是臨床實(shí)驗(yàn)室較理想儀器。

參考文獻(xiàn)

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篇8

【摘要】 將磁性微粒與抗體的偶聯(lián)，通過(guò)優(yōu)化偶聯(lián)條件提高了偶聯(lián)效率，制備了高靈敏度的磁微粒生物探針；采用3(2螺旋金剛烷)4甲氧基4(3鄰氧酰苯基)1，2二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)堿性磷酸酶(ALP)化學(xué)發(fā)光體系，建立了化學(xué)發(fā)光磁酶免疫檢測(cè)方法；對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，提高了系統(tǒng)的靈敏度和檢測(cè)速度，并對(duì)HCG樣品進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果表明，HCG濃度在0.15～150 IU/L范圍內(nèi)，光強(qiáng)隨HCG濃度增大而增加，兩者之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為0.960；檢出限可達(dá)0.15 IU/L; 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5％; 檢測(cè)總時(shí)間少于1 h。本方法可以應(yīng)用于其它免疫分子的檢測(cè)，在臨床免疫檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】 化學(xué)發(fā)光，磁性微球免疫分析，人絨毛膜促性腺激素

Abstract A highly sensitive magnetic enzymelinked chemiluminescent immunoassay method was developed for the detection of human chorionic gonadotropin(HCG). The monoclonal antibody was covalently coupled on the surface of carboxylated magnetic beads to generate magneticbiotargeting; Alkaline phosphatase(ALP) was utilized as a labeled reagent of another monoclonal antibody， whereas 3(2spimadamantane) 4methoxy4(3phosphoryloxy)phenyl1，2dioxetane(AMPPD) was utilized as the chemiluminescent substrate. Based on this concept， a highly sensitive chemiluminescent immunoassay method was established to test HCG. Then， several modifications were made to optimize the method， and the detection sensitivity and procedure were improved accordingly. The detection of the assay could be fulfilled within 60 min and the test result of HCG concentration was linear over the range of 0.15 150 IU/L with good relativity(r=0.960). The relative standard deviation(RSD) were below 5% and the sensitivity of this method was 0.15 IU/L. The proposed method with wide linear range， simple operation and fast detection showed good prospect in practical application onsite.

Keywords Chemiluminescence， magnetic immunoassay， human chorionic gonadotropin

1 引 言

人絨毛膜促性腺激素(HCG)是由滋養(yǎng)葉層的合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，存在于孕婦的血液、尿、初乳、羊水和胎兒體內(nèi)，對(duì)維持正常妊娠有重要意義[1，2]。婦女懷孕后，HCG濃度會(huì)按一定規(guī)律變化。醫(yī)生可根據(jù)異常情況判斷是否先兆流產(chǎn)、異位妊娠、葡萄胎等。某些婦產(chǎn)科疾病、術(shù)后治療過(guò)程等都需要跟蹤HCG指標(biāo)變化[3]。目前，臨床診斷中HCG檢測(cè)方法有放射免疫分析[4]、電化學(xué)免疫分析[5] 、熒光免疫分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析等[6，7]。其中化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法將磁性分離技術(shù)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)與免疫學(xué)方法三者相結(jié)合，綜合了化學(xué)發(fā)光法靈敏度高、線性范圍廣、測(cè)定速度快以及免疫法的特異性高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，還利用了磁性微粒在磁場(chǎng)可控運(yùn)動(dòng)的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的快速富集，具有更快的檢測(cè)速度[8，9]。國(guó)外已經(jīng)相繼開(kāi)發(fā)出了基于化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法的試劑盒，成功地應(yīng)用于多種免疫分子的臨床檢測(cè)，但試劑價(jià)格昂貴，其配套裝置也多為大型檢測(cè)儀。

本研究將磁酶免疫與化學(xué)發(fā)光的高靈敏度優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，利用3(2螺旋金剛烷)4甲氧基4(3鄰氧酰苯基)1，2二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)堿性磷酸酶(ALP)化學(xué)發(fā)光體系，建立了HCG化學(xué)發(fā)光磁酶免疫檢測(cè)方法。其中發(fā)光底物AMPPD是一種新型二氧雜環(huán)丁烷類(lèi)化學(xué)發(fā)光試劑，可在堿性磷酸酶（ALP）的催化下發(fā)光。與傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光試劑相比，性能穩(wěn)定，幾乎無(wú)背景干擾，試劑存放時(shí)間較長(zhǎng)，具有極高的檢測(cè)靈敏度[10]。磁性納米材料經(jīng)過(guò)相應(yīng)的化學(xué)修飾后，將一種抗體結(jié)合到固相載體磁性微粒上作為捕獲抗體，將另外一種抗體用堿性磷酸酶（ALP）進(jìn)行標(biāo)記，加入待測(cè)物后，發(fā)生免疫反應(yīng)，形成雙抗體夾心物。利用磁分離技術(shù)，經(jīng)過(guò)清洗去除多余抗體后，加入底物AMPPD，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)待測(cè)物的量。本研究?jī)?yōu)化和改進(jìn)了磁性微粒與抗體的偶聯(lián)和免疫分析條件，可以采用本實(shí)驗(yàn)室自制的小型微弱光檢測(cè)儀[11]進(jìn)行檢測(cè)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)HCG的快速、靈敏檢測(cè)。

本方法也可應(yīng)用于其它免疫分子的檢測(cè)，在臨床檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

F4500熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）； 尼康TE2000U熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；磁分離架（天津倍爾樂(lè)生物公司）；JQ1型免疫反應(yīng)振蕩器（上海強(qiáng)運(yùn)科技有限公司）。

HCG抗原（青島康原藥業(yè)）；抗HCG抗體（杭州隆基生物有限公司）；堿性磷酸酶標(biāo)記抗HCG抗體（ALPHCG）； AMPPD（福建波生生物有限公司）；羧基末端磁性微球（粒徑3 μm，陜西北美基因股份有限公司）；碳二亞胺（EDC）、甘氨酸（上海共價(jià)科技有限公司）；牛血清蛋白（BSA）、乙磺酸（MES）和土溫20（Tween20）均購(gòu)自北京欣京科生物技術(shù)有限公司；0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4），0.1 mol/L乙磺酸緩沖液（MES， pH=6.0），清洗液PBST（0.1 mol/L PBS， 0.1% Tween20， pH=6.5），保存液（0.1 mol/L PBS， 1% BSA， pH=7.4）均由實(shí)驗(yàn)室配制；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水；其它試劑均為分析純。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 羧基末端磁性微球與抗體的偶聯(lián)

取羧基末端磁性微球1 mg，置于磁分離架上2 min，棄去上清液；加入PBS緩沖液 400 μL，吹打均勻，置于磁分離架上分離，棄去上清液，如此清洗2次。清洗完畢后，加入6 g/L EDC溶液(pH 6.0) 400 μL進(jìn)行磁性微球活化，吹打均勻后，置于振蕩器上，反應(yīng)30 min。然后加入抗體進(jìn)行偶聯(lián)，向活化后的磁微粒中加入1 g/L抗體溶液400 μL，置于振蕩器上反應(yīng)6 h；偶聯(lián)完成后，加入1 mol/L 甘氨酸400 μL封閉磁性微球表面的活性基團(tuán)，混勻后，置于振蕩器上反應(yīng)30 min；加入PBST緩沖液 400 μL，吹打均勻，置于磁分離架上分離，棄去上清液，如此清洗2次；最后加入1 mL保存液，混勻后置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 偶聯(lián)效率的檢測(cè)

為了考察偶聯(lián)條件對(duì)偶聯(lián)效果的影響，本研究采用熒光素標(biāo)記的抗體作為捕獲抗體與磁性微球進(jìn)行偶聯(lián)。首先利用F4500對(duì)偶聯(lián)抗體的激發(fā)光與發(fā)射光進(jìn)行分析，獲得光譜特性。然后將配置不同濃度的偶聯(lián)抗體，利用F4500進(jìn)行熒光光強(qiáng)檢測(cè)，求得抗體濃度與光強(qiáng)的線性關(guān)系。依照上述偶聯(lián)方法進(jìn)行抗體偶聯(lián)，抗體偶聯(lián)完畢后，取上清液檢測(cè)其熒光光強(qiáng)；將光強(qiáng)值代入求得的線性方程中，可求得上清液的抗體濃度。由于偶聯(lián)時(shí)加入的抗體濃度已知，據(jù)此可以求得偶聯(lián)到磁性微球上的抗體的量，計(jì)算抗體的偶聯(lián)效率。

2.2.3 化學(xué)發(fā)光光強(qiáng)的檢測(cè)

采用了實(shí)驗(yàn)室自制的微弱光檢測(cè)儀[11]進(jìn)行檢測(cè)，將發(fā)光底物與酶混合后加入微量光學(xué)反應(yīng)池中，光強(qiáng)信號(hào)通過(guò)弱光采集模塊被放大并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)輸出。電信號(hào)與光強(qiáng)信號(hào)成正比，可以作為光強(qiáng)輸出值進(jìn)行分析。

2.3.4 HCG樣品的檢測(cè)

取50 μL羧基末端磁性微球抗體復(fù)合物加入150 μL HCG溶液，再加入70 μL堿磷酶標(biāo)記的抗體，37 ℃反應(yīng)20 min；將反應(yīng)產(chǎn)物置于磁分離架2 min，棄去上清液；然后加入去離子水250 μL，吹打均勻，置于磁分離架2 min，棄去上清液，如此清洗2次；加入100 μL 0.01 mol/L Na2CO3溶液，再加入50 μL AMPPD，混勻后置于微弱光檢測(cè)儀中檢測(cè)光強(qiáng)。

3 結(jié)果與討論

3．1 羧基末端磁性微球與抗體偶聯(lián)

偶聯(lián)體系pH的選擇 本研究采用羧基末端磁性微球作為捕獲抗體的固相載體，以碳二亞胺EDC為縮合偶聯(lián)劑，使磁性微球表面的羧基與蛋白質(zhì)的氨基脫水形成酰胺鍵，從而實(shí)現(xiàn)抗體與磁性微球的偶聯(lián)。EDC是一種化學(xué)性質(zhì)非?；顫姷碾p功能試劑，受反應(yīng)體系的pH值影響較大。

實(shí)驗(yàn)采用MES緩沖液，加入不同濃度的K2CO3或HCl調(diào)節(jié)偶聯(lián)反應(yīng)體系的pH，研究體系pH對(duì)偶聯(lián)效率的影響，結(jié)果如圖1曲線a所示。結(jié)果表明，偶聯(lián)體系在pH=4時(shí)，偶聯(lián)效率6 時(shí)，偶聯(lián)效率開(kāi)始降低。因此，本實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)體系的pH值為6。

3．1．2 偶聯(lián)時(shí)間的影響

在其它條件不變的情況下，進(jìn)行磁性微球與抗體偶聯(lián)，然后在不同時(shí)間終止反應(yīng)，研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)偶聯(lián)效率的影響，結(jié)果如圖1曲線b所示。結(jié)果表明：隨著時(shí)間的增加，偶聯(lián)效率不斷增加，在0～2 h內(nèi)，偶聯(lián)效率從0迅速增長(zhǎng)到50%；2～6 h時(shí)偶聯(lián)效率從50%迅速增長(zhǎng)到70%，增速變緩；反應(yīng)6 h后，反應(yīng)趨于平衡，偶聯(lián)效率基本保持不變。因此偶聯(lián)時(shí)間選擇6 h，這樣既保證偶聯(lián)效率較高，又避免了反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成抗體失活。

3．2 HCG檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3．2．1 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)時(shí)間的選擇

取0.1 μmol/L AMPPD 50 μL，加入100 μL 3 mg/L ALPHCG(pH=9.5)，于檢測(cè)皿中進(jìn)行發(fā)光強(qiáng)度時(shí)間掃描(圖2)。結(jié)果表明，光強(qiáng)隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，0～30 min內(nèi)化學(xué)發(fā)光光強(qiáng)隨時(shí)間的延遲而不斷增長(zhǎng)，這是因?yàn)锳LP催化AMPPD發(fā)光過(guò)程分為兩個(gè)階段：首先，AMPPD在ALP的催化裂解下脫去1個(gè)磷酸基，得到1個(gè)陰離子AMPD，然后AMPD經(jīng)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)會(huì)產(chǎn)生光子，而AMPD在一定環(huán)境下有2～30 min的半衰期；當(dāng)反應(yīng)30 min時(shí)光強(qiáng)基本穩(wěn)定，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，光強(qiáng)基本保持不變。因此，為了提高檢測(cè)速度，檢測(cè)時(shí)間選擇30 min較理想。

3．2．2 羧基末端磁性微球量的選擇

取50 μL ALPHCG，150 μL 150 IU/L HCG溶液，然后加入不同量的羧基末端磁性微球抗體復(fù)合物進(jìn)行孵育后，清洗3次，然后加入發(fā)光底物檢測(cè)發(fā)光光強(qiáng)，研究羧基末端磁性微球濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，磁微球量為20 μg時(shí)，捕獲抗體濃度較低，免疫反應(yīng)效率低，最終產(chǎn)物發(fā)光強(qiáng)度較低。隨著磁性微球量的增加，發(fā)光強(qiáng)度迅速增加。當(dāng)磁微球的量達(dá)到50 μg時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大。磁微球懸濁液會(huì)吸收穿過(guò)溶液的光，濃度越高吸收得越多，磁微球的量超過(guò)50 μg后，發(fā)光光強(qiáng)開(kāi)始減弱。因此，為保證檢測(cè)時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)中選擇磁性微球的量為50 μg。

3．2．3 ALPHCG濃度的影響

取50 μg羧基末端磁性微球抗體復(fù)合物，加入75 IU/L HCG溶液150 μL，然后加入不同濃度的ALPHCG進(jìn)行孵育后，清洗3次，然后加入發(fā)光底物檢測(cè)發(fā)光光強(qiáng)，研究ALPHCG濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)體系中無(wú)ALPHCG時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度為零，隨著ALPHCG濃度的增加，發(fā)光強(qiáng)度迅速增加。當(dāng)ALPHCG濃度高于7.5 mg/L，發(fā)光強(qiáng)度增加趨于平緩?？紤]到檢測(cè)試劑的成本，實(shí)驗(yàn)中選擇ALPHCG的濃度為7.5 mg/L。

3．3 HCG檢測(cè)結(jié)果

3．3．1 HCG樣品檢測(cè)

用PBS溶液對(duì)HCG原液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)纬刹煌瑵舛鹊腍CG溶液；在最優(yōu)化的配比和檢測(cè)條件下，對(duì)0.15～150 IU/L的HCG樣品進(jìn)行檢測(cè)得知，HCG濃度與檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。線性回歸方程為：y=6.455x+122.36，相關(guān)系數(shù)r＝0.960。檢出限可達(dá)0.15 IU/L，每個(gè)樣品測(cè)定總時(shí)間少于1 h，可以滿足對(duì)微量HCG進(jìn)行快速靈敏檢測(cè)的需求。

3．3．2 重現(xiàn)性

對(duì)75 IU/L HCG溶液連續(xù)檢測(cè)6次，檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%（見(jiàn)表1），說(shuō)明本方法重現(xiàn)性良好。結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，檢測(cè)速度快，適用于檢測(cè)血清中的HCG。表1 系統(tǒng)重現(xiàn)性測(cè)試結(jié)果（略）

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篇9

【關(guān)鍵詞】發(fā)光；功能化；納米材料

納米材料在實(shí)際應(yīng)用中，其主要特點(diǎn)是比表面積大、化學(xué)反應(yīng)活性強(qiáng)以及具有良好的尺寸效應(yīng)，能夠和生物體產(chǎn)生特殊的相互作用。在生物標(biāo)記以及分析檢測(cè)中則主要是作為生物探針應(yīng)用，同時(shí)納米技術(shù)、生物技術(shù)以及分析技術(shù)的良好結(jié)合，也進(jìn)一步促進(jìn)了功能性納米材料的發(fā)展及應(yīng)用。本文則從發(fā)光功能化角度，對(duì)納米材料的發(fā)展及應(yīng)用探討。

1納米材料在電化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光生物傳感中的應(yīng)用

其中將CdTe量子點(diǎn)作為標(biāo)志物的免疫傳感器，能夠同時(shí)測(cè)定人IgG抗原作為模型蛋白的熒光及電化學(xué)。首先借助于聚陽(yáng)離子電解質(zhì)PDDA能夠在導(dǎo)電玻璃上將金膠納米粒子在ITO芯片上被成功吸附，之后在金膠納米離子上固定羊抗人IgG抗體，再實(shí)施封閉處理之后芯片則能夠和檢測(cè)出現(xiàn)抗原反應(yīng)，并和量子點(diǎn)標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體反應(yīng)。在以上反應(yīng)結(jié)束后可以進(jìn)行熒光及電化學(xué)方式檢測(cè)。其中電致化學(xué)發(fā)光則是有效結(jié)合電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)方法，應(yīng)用也比較廣泛。量子點(diǎn)特點(diǎn)則為熒光特性獨(dú)特以及生物相容性好，在其應(yīng)用過(guò)程中將硫基乙酸作為穩(wěn)定劑，則能夠成功合成水溶性Cds納米晶體。在對(duì)進(jìn)行分析過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)水溶液中會(huì)出現(xiàn)電致化學(xué)發(fā)光行為。采用自組裝方式和納米金放大技術(shù)相結(jié)合，在金電極上修飾Cds納米晶，則能夠構(gòu)建新型ECL免疫傳感器，主要是在低濃度脂蛋白檢測(cè)中應(yīng)用。這一材料在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的電化學(xué)發(fā)光以及生物相容性，能夠進(jìn)一步構(gòu)建量子點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，主要應(yīng)用在人免疫球蛋白靈敏性檢測(cè)工作中。

2納米材料在聚合物電致發(fā)光中的應(yīng)用

聚合物電致發(fā)光在應(yīng)用中主要優(yōu)勢(shì)為：主動(dòng)發(fā)光，并且效率高、寬視角、能耗低、厚度小、操作簡(jiǎn)單等等，在照明及平板顯示領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用發(fā)展前景，目前已經(jīng)在全世界科學(xué)界及工業(yè)界得到普遍關(guān)注。聚合物電致發(fā)光二極管的首次研究則是在1990年，英國(guó)機(jī)劍橋大學(xué)首次報(bào)道關(guān)于聚對(duì)苯乙烯的聚合物電致發(fā)光二極管，在采用溶液法將聚合物前驅(qū)體進(jìn)行成膜之后，放置在2500C真空高溫環(huán)境中進(jìn)行處理，最終為均勻、致密的PPV薄膜，器件的陰陽(yáng)極分別是Al和ITO，在＜14V電壓環(huán)境下則能夠?qū)崿F(xiàn)外量子效率0.05%黃綠光發(fā)光。PPV則屬于是難溶性共軛聚合物，在其處理過(guò)程中一定要選用前驅(qū)體方式進(jìn)行旋涂成膜，在操作過(guò)程中工藝復(fù)雜，同時(shí)薄膜質(zhì)量也比較差。在1991年美國(guó)加州大學(xué)則提出可通行的甲氧基異辛氧基對(duì)聚對(duì)苯乙烯進(jìn)行取代，能夠在ITO上旋涂MEH-PPV溶液成膜，從而實(shí)現(xiàn)發(fā)光層，即將金屬Ca作為陰極則能夠得到1%橘紅色發(fā)光二極管，這一工藝在操作中簡(jiǎn)單，同時(shí)具有高發(fā)光率聚合物電致發(fā)光二極管。1992年則進(jìn)一步采用柔性塑料基底則可彎曲聚合物電致發(fā)光二極管，從而呈現(xiàn)出聚合物電致發(fā)光二極管最為迷人一面。在近些年來(lái)，世界對(duì)聚合物電致發(fā)光材料及期間的研究一直都比較重視，并取得顯著進(jìn)步，但是就目前而言不管是聚合物電致發(fā)光器件穩(wěn)定性還是效率上均還有進(jìn)步空間，因此還需要進(jìn)一步加大研究。

3納米材料在化學(xué)發(fā)光免疫分析中的應(yīng)用

化學(xué)發(fā)光免疫分析則是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法兩者的結(jié)合產(chǎn)物，在納米技術(shù)迅速發(fā)展進(jìn)程中，納米材料的無(wú)機(jī)有機(jī)自組裝復(fù)合研究也發(fā)展迅速。其中在研究過(guò)程中將納米材料作為新型免疫標(biāo)記物，和高效液相色譜分析法、分子印跡法以及毛細(xì)管電泳分析法等一系列現(xiàn)代分離技術(shù)及分析方法相結(jié)合，則能夠有效構(gòu)建具有良好靈敏度及特異度的納米材料化學(xué)發(fā)光免疫分析法，不但能夠廣泛應(yīng)用在藥物檢測(cè)中，同時(shí)也能夠應(yīng)用在蛋白質(zhì)、DNA以及疾病病原體等一系列檢驗(yàn)中。同時(shí)在研究過(guò)程中納米標(biāo)記探針的出現(xiàn)，則進(jìn)一步讓人們?cè)诩{米尺度上分析及檢測(cè)生命機(jī)體痕量物質(zhì)，在生命活動(dòng)機(jī)理以及疾病早期診斷預(yù)防中均具有重要應(yīng)用價(jià)值。和納米材料在魯米諾體系化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)中的參與作用具有差異，其應(yīng)用則可以將其分成：催化增敏型、標(biāo)記溶出型、能量受體型以及負(fù)載平臺(tái)型四種，不同類(lèi)型均具有不同作用。

4結(jié)語(yǔ)

具有發(fā)光功能化的納米材料的研究越來(lái)越全面深入，在此過(guò)程中我們能夠發(fā)現(xiàn)在納米材料及其技術(shù)發(fā)展進(jìn)程中，不管是藥物、醫(yī)學(xué)，還是食品以及環(huán)境等領(lǐng)域，化學(xué)發(fā)光免疫分析法已經(jīng)廣泛應(yīng)用在有機(jī)物和無(wú)機(jī)物微量及痕量分析工作中。在化學(xué)發(fā)光免疫分析法中，納米材料的參與作用則是高效催化劑，不管是納米生物探針還是量子點(diǎn)熒光劑等方面均具有廣闊應(yīng)用前景。同時(shí)在其發(fā)展進(jìn)程中和一系列現(xiàn)代分析技術(shù)結(jié)合應(yīng)用之后，則能夠?qū)瘜W(xué)發(fā)光分析方法的靈敏度、穩(wěn)定性以及選擇性顯著提升，同時(shí)還能夠進(jìn)一步擴(kuò)大其檢測(cè)方法的應(yīng)用范圍。同時(shí)在采用以上一系列方法制成的化學(xué)發(fā)光分析儀，具有良好的自動(dòng)化水平，同時(shí)操作簡(jiǎn)單，能夠有效實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，特別是在環(huán)境監(jiān)測(cè)、醫(yī)學(xué)監(jiān)測(cè)以及食品安全監(jiān)測(cè)等方面具有良好的應(yīng)用前景，也有助于進(jìn)一步促進(jìn)化學(xué)發(fā)光免疫分析法的研究及發(fā)展。以上本文關(guān)于發(fā)光功能性納米材料的應(yīng)用有簡(jiǎn)要分析，以能夠?yàn)橥泄ぷ餮芯空咛峁┮欢ǖ膮⒖假Y料，

參考文獻(xiàn)：

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篇10

關(guān)鍵詞 石英毛細(xì)管； 甲胎蛋白； 免疫分析； 灰度分析

1 引 言

隨著我國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的快速發(fā)展和人們對(duì)健康保健的日益重視， 社會(huì)對(duì)實(shí)用性的檢測(cè)技術(shù)需求越來(lái)越多， 體外診斷的新方法、新技術(shù)已成為生物分析檢測(cè)的熱點(diǎn)和重點(diǎn)研發(fā)方向。目前， 低成本、操作簡(jiǎn)便、小型化的體外診斷方法和裝備的研究正受到科研機(jī)構(gòu)和醫(yī)療檢測(cè)市場(chǎng)的廣泛關(guān)注。

現(xiàn)有的體外診斷產(chǎn)品中， 免疫檢測(cè)類(lèi)產(chǎn)品占比很大， 主要采用酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法以及膠體金免疫層析法[1～3]。前兩者以微孔板為檢測(cè)載體， 技術(shù)較成熟， 但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)， 一般需要2～3 h； 電化學(xué)發(fā)光法主要基于磁珠捕獲抗原進(jìn)行檢測(cè)， 檢測(cè)速度快， 一般可在30 min內(nèi)完成， 但檢測(cè)成本較高， 約為酶聯(lián)免疫吸附法的3～4倍； 放射性免疫檢測(cè)靈敏度高， 但對(duì)操作環(huán)境及操作人員要求很高； 膠體金免疫層析檢測(cè)速度快， 可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)， 但難以實(shí)現(xiàn)定量分析。近年來(lái)， 一些學(xué)者報(bào)道了基于納米材料及微流控技術(shù)的新型體外免疫診斷方法， 但納米材料的制備較難控制其穩(wěn)定性， 真正實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的并不多見(jiàn)[4，5]。本課題組多年從事毛細(xì)管電泳生物醫(yī)藥分析研究， 所用的分離載體是熔融石英毛細(xì)管， 其性質(zhì)穩(wěn)定， 透光性好， 表面易進(jìn)行物理、化學(xué)修飾， 加工工藝成熟， 成本低廉[6～10]。本實(shí)驗(yàn)將熔融石英毛細(xì)管用于免疫檢測(cè)的載體材料， 研究基于灰度值分析的血清中甲胎蛋白的免疫檢測(cè)方法， 目的是實(shí)現(xiàn)基于石英毛細(xì)管材料和灰度分析的定量免疫檢測(cè)。傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)器大多采用光電倍增管， 檢測(cè)區(qū)域有限， 分析速度慢， 而以電感耦合器件（CCD）為代表的圖像傳感器則可以提供更加廣泛的檢測(cè)區(qū)域， 具有光電轉(zhuǎn)換效率高、動(dòng)態(tài)線性范圍寬、多通道同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)， 成為未來(lái)生物傳感器的一個(gè)發(fā)展方向[11，12]。實(shí)驗(yàn)中使用的便攜式化學(xué)發(fā)光成像儀采用制冷CCD， 靈敏度高， 體積小， 僅有0.006 m3， 能夠高效捕獲化學(xué)發(fā)光信號(hào)， 形成圖片?；叶仁侵负诎讏D像中點(diǎn)的顏色深度， 灰度分析法具有結(jié)果直觀， 分析快速等優(yōu)點(diǎn)， 在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、圖像識(shí)別領(lǐng)域有廣泛的用途[13]， 很多體外診斷試劑的檢測(cè)應(yīng)用也采用灰度值分析方法[14]。

本研究以熔融石英毛細(xì)管為載體， 建立了基于灰度分析的免疫檢測(cè)方法。以腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）為模型蛋白， 通過(guò)雙抗體夾心方式進(jìn)行檢測(cè)， 與抗體偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）催化化學(xué)發(fā)光底物液發(fā)光， 產(chǎn)生的光信號(hào)通過(guò)成像儀轉(zhuǎn)化為圖片[12，15，16]， 進(jìn)行灰度值分析。研究結(jié)果表明， 毛細(xì)管免疫檢測(cè)和灰度分析結(jié)合， 實(shí)際使用的樣本量?jī)H為0.8 μL， 而ELISA檢測(cè)一般需要50 μL， 因此本方法大幅降低了樣本使用量。檢測(cè)過(guò)程中僅需石英毛細(xì)管、醫(yī)用注射器等常用耗材， 操作簡(jiǎn)單， 不依賴(lài)大型儀器。所建方法具有普適性， 可用于基于化學(xué)發(fā)光免疫分析的生物標(biāo)志物的快速檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑：

便攜式化學(xué)發(fā)光成像儀（國(guó)家納米科學(xué)中心研制）； 熔融石英毛細(xì)管（北京華陽(yáng)利民儀器有限公司）； 醫(yī)用注射器（北京科龍生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）； 表面活化劑（美國(guó)Anteo Technologies公司）； 磷酸鹽緩沖液（PBS）和小牛血清白蛋白（BSA）（德國(guó)Merck公司）； AFP捕獲抗體、AFP的HRP酶標(biāo)抗體及AFP標(biāo)準(zhǔn)液（北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司）； 癌胚抗原（CEA）標(biāo)準(zhǔn)液、前列腺特異性抗原（PSA）標(biāo)準(zhǔn)液、糖類(lèi)抗原125（CA125）標(biāo)準(zhǔn)液及糖類(lèi)抗原199（CA199）標(biāo)準(zhǔn)液（北京沫之東生物技術(shù)有限公司）； 化學(xué)發(fā)光底物液（美國(guó)Millipore公司）； 實(shí)驗(yàn)用水由Millipore純水儀制備。

2.2 分析方法

2.2.1 實(shí)驗(yàn)操作步驟 實(shí)驗(yàn)步驟如圖1所示：（1）活化毛細(xì)管 將毛細(xì)管裁剪為10 cm長(zhǎng)， 使用醫(yī)用注射器將表面活化劑注入毛細(xì)管， 室溫靜置30 min， 對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行活化后， 用水沖洗。（2）固定捕獲抗體及封閉 將AFP的捕獲抗體按照一定比例用PBS稀釋?zhuān)?將稀釋液注入毛細(xì)管內(nèi)部， 室溫靜置1 h后再用PBS清洗， 將含5% BSA的PBS溶液注入毛細(xì)管中， 室溫靜置30 min進(jìn)行封閉。（3）注入待測(cè)蛋白 將待測(cè)蛋白AFP溶液注入到毛細(xì)管， 室溫孵育30 min后用PBS清洗。（4）注入酶標(biāo)抗體及化學(xué)發(fā)光底物液 將稀釋為一定濃度的HRP酶標(biāo)抗體注入毛細(xì)管， 室溫孵育30 min， PBS沖洗后注入化學(xué)發(fā)光底物液。

2.2.2 成像分析 將化學(xué)發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化為圖片形式， 進(jìn)行成像灰度分析。毛細(xì)管置于成像儀中， 選擇一定的曝光時(shí)間， 檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)。毛細(xì)管中的化學(xué)發(fā)光底物在酶標(biāo)抗體上HRP酶的催化作用下產(chǎn)生的光信號(hào)轉(zhuǎn)化為圖片。圖片上的灰度值表示待測(cè)蛋白AFP抗原的濃度。通過(guò)ImageJ軟件分析圖片， Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 毛細(xì)管內(nèi)徑對(duì)檢測(cè)的影響

市售毛細(xì)管有多種內(nèi)徑， 考察了不同內(nèi)徑毛細(xì)管對(duì)檢測(cè)的影響。毛細(xì)管內(nèi)徑不同， 可提供抗體結(jié)合的位點(diǎn)面積不同。內(nèi)徑較小的毛細(xì)管， 可節(jié)省樣品， 但內(nèi)壁表面積較小， 可吸附的捕獲抗體的量較小， 因而后續(xù)可結(jié)合的抗原以及酶標(biāo)抗體也較少， 故化學(xué)發(fā)光信號(hào)較弱， 灰度低， 不利于靈敏檢測(cè)。較大內(nèi)徑的毛細(xì)管所提供的內(nèi)壁表面積大， 可吸附的捕獲抗體量增加， 可結(jié)合的抗原及酶標(biāo)抗體也增加， 化學(xué)發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)?？疾炝?0， 75， 100， 150和200 μm內(nèi)徑的毛細(xì)管， 分別檢測(cè)相同濃度的AFP， 比較其灰度強(qiáng)度。結(jié)果表明， 灰度強(qiáng)度所指示的化學(xué)發(fā)光信號(hào)與AFP濃度呈正相關(guān)（圖2和圖3）?；叶日掌突叶葟?qiáng)度均顯示毛細(xì)管內(nèi)徑對(duì)AFP檢測(cè)有明顯影響。使用50 μm毛細(xì)管， 灰度強(qiáng)度較弱； 內(nèi)徑增加到75 μm， 灰度強(qiáng)度增大； 使用100 μm內(nèi)徑毛細(xì)管， 灰度較強(qiáng)且均勻； 當(dāng)內(nèi)徑大于100 μm時(shí)， 信號(hào)強(qiáng)度降低， 且在橫截面方向上信號(hào)分布不均。理論上， 大內(nèi)徑的毛細(xì)管可提供的內(nèi)壁表面積大， 可吸附的捕獲抗體量多， 可結(jié)合的抗原及酶標(biāo)抗體也多， 可使信號(hào)線性增強(qiáng)， 直至趨于飽和。然而由圖2可見(jiàn)， 150 μm內(nèi)徑時(shí)信號(hào)不均。 可能是由于與拍攝方向相切的內(nèi)壁上下沿區(qū)域光程較長(zhǎng)， 出現(xiàn)內(nèi)壁上下沿信號(hào)較強(qiáng)， 中部信號(hào)偏弱的現(xiàn)象?；叶刃盘?hào)不均勻不利于準(zhǔn)確分析， 且增加了各種試劑和樣品用量。因此， 實(shí)驗(yàn)選擇內(nèi)徑100 μm的毛細(xì)管。

3.2 免疫分析的條件優(yōu)化

3.2.1 捕獲抗體濃度 捕獲抗體在毛細(xì)管內(nèi)的固定效果很大程度上決定了檢測(cè)的靈敏度。通常捕獲抗體在毛細(xì)管內(nèi)壁的密度越高， 檢測(cè)靈敏度越高， 但過(guò)高濃度的捕獲抗體， 會(huì)造成過(guò)飽和， 浪費(fèi)抗體試劑。本實(shí)驗(yàn)中， 固定AFP濃度和酶標(biāo)抗體濃度， 對(duì)捕獲抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化， 將所購(gòu)的捕獲抗體稀釋?zhuān)?稀釋倍數(shù)為25， 50， 100， 150， 200， 250和300倍， 比較檢測(cè)的灰度值。當(dāng)捕獲抗體的稀釋倍數(shù)為150， 200， 250和300倍時(shí)， 隨稀釋倍數(shù)增大， 溶液濃度降低， 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號(hào)逐漸減小， 說(shuō)明溶液中的捕獲抗體濃度偏低， 固定到毛細(xì)管內(nèi)壁的捕獲抗體量較少， 不能充分結(jié)合抗原， 故化學(xué)發(fā)光值隨稀釋倍數(shù)增大而降低， 灰度值減?。?當(dāng)稀釋倍數(shù)為50和25倍時(shí)， 捕獲抗體的濃度因稀釋比例小而保持較高的水平， 但其化學(xué)發(fā)光信號(hào)卻與捕獲抗體稀釋100倍時(shí)相當(dāng)， 并未增強(qiáng)， 說(shuō)明當(dāng)捕獲抗體稀釋倍數(shù)為100時(shí)， 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號(hào)趨于飽和， 增加濃度不再使抗體在毛細(xì)管內(nèi)壁的分布密度增加， 且當(dāng)稀釋倍數(shù)為100時(shí)， 結(jié)合到毛細(xì)管內(nèi)壁上的捕獲抗體能夠完全結(jié)合抗原。因此， 選擇稀釋100倍為捕獲抗體最佳的稀釋比例（圖4）。

3.2.2 酶標(biāo)抗體溶度

酶標(biāo)抗體的濃度也直接影響檢測(cè)結(jié)果。如果酶標(biāo)抗體濃度偏低， 不能與抗原充分結(jié)合， 就會(huì)造成實(shí)際檢測(cè)信號(hào)值偏低。如果酶標(biāo)抗體濃度偏高， 雖然反應(yīng)充分， 但是可能浪費(fèi)試劑。實(shí)驗(yàn)中， 固定捕獲抗體稀釋倍數(shù)和AFP抗原濃度， 對(duì)檢測(cè)抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化。將所購(gòu)的酶標(biāo)抗體稀釋?zhuān)?稀釋倍數(shù)為100， 150， 200， 250， 300和350倍， 比較不同稀釋濃度的灰度值。結(jié)果表明， 酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為250， 300， 350倍時(shí)， 隨稀釋比例增大， 酶標(biāo)抗體濃度降低， 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號(hào)逐漸減小， 說(shuō)明酶標(biāo)抗體濃度偏低， 反應(yīng)不充分； 稀釋倍數(shù)為150和100倍時(shí)， 酶標(biāo)抗體濃度隨稀釋比例減小而增大， 但灰度值與稀釋倍數(shù)200時(shí)相比未見(jiàn)增加。說(shuō)明稀釋倍數(shù)為200時(shí)， 灰度值趨于飽和， 抗原抗體結(jié)合較為充分。因此， 酶標(biāo)抗體最佳的稀釋倍數(shù)為200倍。

3.2.3 孵育時(shí)間

孵育時(shí)間是免疫檢測(cè)的重要參數(shù)。如孵育時(shí)間過(guò)短， 反應(yīng)進(jìn)行不充分， 影響檢測(cè)的靈敏度。若孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 則耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。室溫下， 將AFP抗原及AFP酶標(biāo)抗體的孵育時(shí)間分別設(shè)定為5， 15， 30， 60和90 min， 比較灰度值變化。結(jié)果表明， 孵育15 min 的灰度值即化學(xué)發(fā)光信號(hào)比孵育5 min時(shí)明顯升高， 說(shuō)明5和15 min的孵育時(shí)間偏短， 反應(yīng)尚不充分； 孵育時(shí)間設(shè)為30， 60和90 min時(shí)， 灰度值沒(méi)有增加。說(shuō)明孵育時(shí)間為30 min時(shí)， 灰度值趨于飽和， 免疫反應(yīng)較為充分。因此， 選擇最佳孵育時(shí)間30 min（圖5）。

3.2.4 曝光時(shí)間優(yōu)化 曝光時(shí)間是化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)的重要參數(shù)。曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 會(huì)造成高濃度AFP檢測(cè)信號(hào)過(guò)飽和； 曝光時(shí)間過(guò)短， 會(huì)造成低濃度AFP檢測(cè)信號(hào)微弱， 都不利于圖像分析， 因此有必要對(duì)曝光時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。固定捕獲抗體及酶標(biāo)抗體濃度， 對(duì)高濃度（100 ng/mL）和低濃度（3 ng/mL）的AFP分別進(jìn)行檢測(cè)， 曝光時(shí)間為5， 10， 15， 20 和25 s， 選擇同時(shí)滿足高濃度和低濃度AFP抗原檢測(cè)的合適曝光時(shí)間。當(dāng)曝光時(shí)間為15 s時(shí)， 3 ng/mL AFP抗原灰度值較弱， 無(wú)法進(jìn)行圖像分析， 增加曝光時(shí)間， 灰度值增加。當(dāng)曝光時(shí)間為25 s時(shí)， 100 ng/mL AFP抗原灰度值出現(xiàn)過(guò)飽和， 不利于分析。因此， 20 s為最佳曝光時(shí)間， 能夠滿足檢測(cè)需求。

3.3 灰度分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線

選擇3.1～50 ng/mL濃度范圍的AFP樣品溶液， 測(cè)定其灰度值。 灰度值Y與AFP濃度X的關(guān)系為：

Y=

42.9328+53.8242log（X1.5625 ng/mL）2

式中， X的單位為ng/mL。Y與X二者呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系（圖6）， R=0.992。稀釋AFP樣品， 通過(guò)灰度分析， 測(cè)定方法的檢出限為2.7 ng/mL。

在目前的臨床檢驗(yàn)中， 只有當(dāng)AFP濃度超過(guò)20 ng/mL時(shí)， 該結(jié)果才具有一定的臨床診斷意義[17，18]。本方法對(duì)AFP的檢測(cè)范圍在3.1～50 ng/mL之間， 為進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

3.4 檢測(cè)特異性

特異性是評(píng)價(jià)免疫檢測(cè)的重要指標(biāo)之一， 通常用交叉反應(yīng)率表示。實(shí)驗(yàn)中， 分別在血清加入中可能存在的干擾物CEA、 PSA、 CA125和CA199， 在最佳條件下測(cè)定。結(jié)果表明， 交叉反應(yīng)率均小于0.5%， 說(shuō)明上述潛在的干擾組分對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響小， 方法的檢測(cè)特異性好[19]， 抗干擾能力強(qiáng)。

3.5 檢測(cè)準(zhǔn)確性

評(píng)估體外診斷試劑準(zhǔn)確性的方法主要有方法學(xué)比對(duì)和回收實(shí)驗(yàn)兩種。方法學(xué)比對(duì)是將兩種不同的檢測(cè)體系所得結(jié)果進(jìn)行比較， 在臨床化學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道中較為常見(jiàn)[20～22]。將本方法與目前大型醫(yī)院廣泛使用的Roche電化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)。實(shí)際臨床樣本來(lái)源于總醫(yī)院， 使用采血管收集人全血， 在室溫中沉降30 min后， 3000 r/min離心5 min， 收集上層血清， 4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。獲取的20例血清樣本分別采用兩種方法進(jìn)行分析檢測(cè)， 結(jié)果見(jiàn)圖7。兩種方法的線性回歸方程為y=0.148+11095x， R=0.980， 說(shuō)明兩種方法的相關(guān)性良好， 本方法具有較高準(zhǔn)確性， 能夠滿足臨床檢測(cè)要求。通過(guò)回收實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)本方法的準(zhǔn)確性。選用3份人血清， 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定其AFP濃度， 然后分別向血清中加入AFP標(biāo)準(zhǔn)液， 再次測(cè)定其AFP濃度。重復(fù)5次， 計(jì)算得回收率在96.0%～106.7%之間（表1）， 說(shuō)明本檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性較好[20]。

4 結(jié) 論

以熔融石英毛細(xì)管為免疫分析載體材料， 通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像和灰度分析， 建立了血清甲胎蛋白的定量免疫分析檢測(cè)方法。本方法可在3.1～50 ng/mL 濃度范圍實(shí)現(xiàn)甲胎蛋白檢測(cè)， 覆蓋了臨床應(yīng)用的關(guān)鍵濃度， 為本方法的進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?；诿?xì)管為載體的灰度分析免疫檢測(cè)方法的樣本消耗少、載體材料簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低廉， 且不依賴(lài)大型儀器， 適用化學(xué)發(fā)光免疫分析， 具有普適性和較好的臨床檢驗(yàn)應(yīng)用前景。

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