導(dǎo)語(yǔ)：如何才能寫好一篇細(xì)胞生物學(xué)特性，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

【關(guān)鍵詞】 紅斑狼瘡；系統(tǒng)性；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；生物學(xué)特性

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Marrow Mesenchymal Stem Cells，MSC)具有高度自我更新和多向分化的潛能，并具有支持造血和免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用［1］。大量的體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)［2,3］證明它具有誘導(dǎo)免疫耐受和免疫抑制的特性。MSC移植在SLE治療中具有較廣闊的應(yīng)用前景。了解SLE患者自身MSC是否異常是判斷選擇自體或異體MSC移植治療SLE的重要依據(jù)。SLE患者M(jìn)SC的體外擴(kuò)增及其生物學(xué)特性是協(xié)助我們?cè)u(píng)價(jià)SLE患者M(jìn)SC是否存在缺陷的重要方面。

1 資料與方法

1.1 一般資料 9例SLE患者均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，SLE疾病活動(dòng)評(píng)分(SLEDAI)判斷疾病的活動(dòng)程度。9例患者的資料見表1。另選5例性別、年齡匹配的健康者作為對(duì)照組。

1.2 骨髓MSC分離培養(yǎng) 采用羥基淀粉沉淀聯(lián)合Ficoll 密度梯度離心法和貼壁篩選法分離培養(yǎng)MSC。具體方法無(wú)菌操作下抽取骨髓液 10 ml，以 5×105 U/ml 肝素鈉抗凝，先用羥基淀粉按1∶4體積加入，靜置20 min，通過(guò)自然沉降去除下沉的大量紅細(xì)胞，剩余的含大量紅細(xì)胞的下層液體，再用淋巴細(xì)胞分離FicollHypaque常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞。將上述兩步分離所得的骨髓單個(gè)核細(xì)胞充分混勻，懸浮于體積分?jǐn)?shù)為10％的 胎牛血清DMEMLG 培養(yǎng)液中，按約1×106/ml密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶， 置 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的 CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中。當(dāng)顯微鏡下觀察細(xì)胞已達(dá)90%融合時(shí)，則可傳代。用0.5%胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco，美國(guó))消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞并懸浮于完全培養(yǎng)液中，按104/cm2的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3~4天更換1次培養(yǎng)液，約1周待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%左右時(shí)，進(jìn)行再次傳代。

1.3 MTT法檢測(cè)MSC的生長(zhǎng)情況 MTT比色法檢測(cè)SLE患者第2代MSC的生長(zhǎng)情況，作傳代細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線分析。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSC表面分子的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增到第三代時(shí)，分別取100 ul細(xì)胞懸液與鼠抗人CD29、CD44、CD34、CD45抗體室溫反應(yīng)30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 MSC的傳代情況及形態(tài)

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了9例SLE患者和5例健康對(duì)照者M(jìn)SC體外培養(yǎng)。5例健康對(duì)照者M(jìn)SC 均能成功體外擴(kuò)增。9例患者中，5例MSC能傳代擴(kuò)增，傳代率為55.6%。其中女性4例，男性1例，年齡16~26歲，平均年齡21.8歲；病程3~24月，平均病程9.8月；DAI評(píng)分為15~21， 平均評(píng)分為18.6。5例SLE患者均合并有腎損害，其中1例合并有血液系統(tǒng)損害。MSC體外擴(kuò)增不成功的4例SLE患者，均為女性，年齡26~45歲，平均年齡38.2歲；病程6~60月，平均病程37.5月；DAI評(píng)分為1322， 平均評(píng)分為18.5。4例SLE患者均合并有腎損害，其中2例合并有嚴(yán)重血液系統(tǒng)損害。每例患者的臨床資料及MSC體外培養(yǎng)基本情況見表1。

2.1.1 體外擴(kuò)增成功者 5例MSC體外擴(kuò)增成功的SLE患者，MSC生長(zhǎng)情況與健康對(duì)照組相比較：原代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞形態(tài)上與健康對(duì)照組相似，但紡錘形、梭形細(xì)胞的出現(xiàn)稍晚，一般于2~4 d，健康對(duì)照組的一般出現(xiàn)于1~2 d內(nèi)；隨后逐漸見集落形成，原代培養(yǎng)的時(shí)間平均為(14.2±1.45)d，與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形旋渦樣生長(zhǎng)；傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較旺盛，平均傳代時(shí)間(5.8±0.44)d，與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。消化傳代的細(xì)胞于24 h內(nèi)完全貼壁，形態(tài)與健康對(duì)照組相似。

2.1.2 體外擴(kuò)增不成功者 MSC生長(zhǎng)情況與健康對(duì)照組相比較：同等骨髓量分離得到的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量與健康對(duì)照組相比明顯減少，且貼壁的紡錘形、梭形細(xì)胞的出現(xiàn)時(shí)間明顯較晚，一般于6~7 d，且僅零星分布，不成集落生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其中2例可見細(xì)胞少量擴(kuò)增，培養(yǎng)至第15天，約見20％~30％融合的短梭形細(xì)胞生長(zhǎng)(圖3)，至第30天，細(xì)胞基本自行凋亡；另2例至第18天，見部分長(zhǎng)梭形細(xì)胞零星分布，融合少于10％，至第30天細(xì)胞基本自行凋亡。

2.2 MSC表面分子的表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMMSC細(xì)胞表面抗原，結(jié)果顯示體外擴(kuò)增成功的SLE患者BMMSC均高表達(dá)CD29、CD44，而不表達(dá)CD34、CD45，第3代BMMSC純度達(dá)95%以上，且各表面標(biāo)志的表達(dá)與健康對(duì)照組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 MSC的生長(zhǎng)情況

SLE患者第2代MSC生長(zhǎng)趨勢(shì)與健康對(duì)照組相似，第3~4天生長(zhǎng)活躍，第4天后生長(zhǎng)漸緩，第56進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。

3 討論

MSC是骨髓中具有高度自我更新和多向分化潛能的一群干細(xì)胞，體外培養(yǎng)易純化、擴(kuò)增迅速，具有支持造血、免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)免疫耐受的作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了9例SLE患者和5例健康對(duì)照者M(jìn)SC的體外培養(yǎng)。健康對(duì)照者M(jìn)SC 均能成功體外擴(kuò)增。9例SLE患者中，5例可以傳代擴(kuò)增，傳代率為55.6%。有4例SLE患者M(jìn)SC不能成功傳代擴(kuò)增，說(shuō)明部分SLE患者M(jìn)SC存在缺陷。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)能成功傳代的5例SLE患者M(jìn)SC無(wú)論是從細(xì)胞形態(tài)、原代培養(yǎng)所需時(shí)間、平均傳代時(shí)間及表面特異性分子表達(dá)均與健康對(duì)照組無(wú)明顯差異，所培養(yǎng)、擴(kuò)增的細(xì)胞能達(dá)到臨床應(yīng)用的要求。提示這部分SLE患者M(jìn)SC生物學(xué)特性基本正常。

對(duì)兩組擴(kuò)增情況不同的SLE患者的臨床資料進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)未能成功體外擴(kuò)增的SLE患者具有如下的臨床特征：①年齡較大。②病程較長(zhǎng)。③合并有較嚴(yán)重的血液系統(tǒng)損害。④長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用免疫抑制劑。

大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MSC的生物學(xué)特性與年齡密切相關(guān)。骨髓中MSC的含量、質(zhì)量以及細(xì)胞活性隨著年齡的增長(zhǎng)而下降［4,5］。骨髓中MSC的克隆數(shù)隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸減少，且BMMSC分泌SCF、FLT3L、IL6、TGFβ1及SDF1等與自我更新密切相關(guān)的細(xì)胞因子的能力逐漸下降，導(dǎo)致BMMSC的增殖能力逐漸減弱。另外，也有研究者指出［6］，病情較重的SLE患者，從骨髓中可提取的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)原本就較少，所含MSC就更少。然而SLE病情輕重、病程長(zhǎng)短及不同藥物治療是否會(huì)影響SLE患者M(jìn)SC的體外擴(kuò)增、生物學(xué)特性及功能，目前尚未能明確。

我們實(shí)驗(yàn)說(shuō)明SLE患者M(jìn)SC存在一定的異質(zhì)性，因此應(yīng)用MSC治療SLE前，了解患者自身MSC是否存在缺陷是必需的。如果患者M(jìn)SC本身存在缺陷，為避免治療失敗或復(fù)發(fā)，異體MSC輸注為首選；如果MSC本身基本正常，自體MSC輸注將是有效的。SLE患者M(jìn)SC的體外擴(kuò)增及其生長(zhǎng)特性是協(xié)助我們?cè)u(píng)價(jià)SLE患者M(jìn)SC是否存在缺陷的重要方面，為SLE患者M(jìn)SC移植的治療方法提供了理論依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ Haynesworth SE. Baber MA Caplan. Al Surface antigen on human marrowderived mesenchymal stem cells are detected by monoclonal antibodies. Bone，1992，13:6980.

［2］ Tse WT， Pendleton JD， Beyer, et al. Suppression of allogeneic Tcell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation. Transplantation, 2003，(75):389397.

［3］ Tse WT， Pendleton JD， Beyer et al. Suppression of allogeneic Tcell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation. Transplantation, 2003，(75):389397.

［4］ Kotev Emeth S， Savion N， Pri2 chen S， et al. Effect of maturation on the osteogonic response of cultured stromal bone marrow cells to basic fibroblast grow th factor. B one， 2000，27:777783.

篇2

【摘要】 目的 觀察不同年齡段大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adiposederived stromal cells， ADSCs)生物學(xué)特點(diǎn)與年齡的關(guān)系，為臨床尋找理想的種子細(xì)胞并迅速獲取所需ADSCs提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 使用密度梯度離心法分離不同年齡段脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，保留貼壁細(xì)胞傳代，分析脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的純度，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，檢測(cè)其增殖活性、細(xì)胞周期。結(jié)果 不同年齡段ADSCs均貼壁生長(zhǎng)，呈典型ADSCs形態(tài)和生長(zhǎng)特征，傳代細(xì)胞的增殖速度比原代細(xì)胞快，但隨著年齡的增長(zhǎng)，原代及傳代培養(yǎng)ADSCs的增殖能力下降，生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)。結(jié)論 ADSCs的增殖能力和活性隨著年齡的增長(zhǎng)而降低，但各年齡段ADSCs均可滿足臨床不同患者組織工程種子細(xì)胞的要求。

【關(guān)鍵詞】 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；年齡；大鼠；細(xì)胞培養(yǎng)；增殖

ABSTRACT: Objective To investigate biological characteristics of rat adiposederived stromal cells (ADSCs) of different ages. Methods ADSCs were isolated by density gradient centrifugation from different age stages， and cultured in vitro. The adherent cells were preserved to passage， the purity of ADSCs was analyzed by immunocytochemistry method， and cell growth was observed， then proliferation capability and cell cycle were detected. Results All the ADSCs obtained from different age stages grew well and showed good morphology and growth characteristics. The proliferation rate of passage cells was higher than that of primary cells， but the proliferation activity reduced with aging， and cell cycle was prolonged. Conclusion The proliferation capability and activity of ADSCs decreased with aging. However， ADSCs of different age stages can all meet the needs of different patients for tissue engineering seed cells.

KEY WORDS: adipose derived stem cell; age; rat; cell culture; proliferation

組織工程的興起和迅猛發(fā)展為臨床修復(fù)重建帶來(lái)了新的治療途徑，成為目前最有前景的生理性修復(fù)技術(shù)[12]。種子細(xì)胞的選擇是組織工程的基礎(chǔ)和關(guān)鍵之一。2001年ZUK等[3]通過(guò)脂肪抽吸術(shù)獲得脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adiposederived stromal cells， ADSCs)。ADSCs具有來(lái)源豐富、易于獲取、自體移植可以避免排斥反應(yīng)以及許多倫理問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)的含量、質(zhì)量以及活性隨著年齡的增長(zhǎng)而下降[4]。但是不同年齡的ADSCs在體外生長(zhǎng)及增殖能力是否具有差異，是否能夠滿足臨床修復(fù)的需要?ADSCs能否成為組織工程新的最理想的種子細(xì)胞?本研究旨在探討不同年齡階段ADSCs的生長(zhǎng)增殖能力及其機(jī)制，為ADSCs的體外培養(yǎng)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM、胎牛血清(Gibco)、Ⅰ型膠原酶(Sigma)、EDTA、MTT(Amerison)、CD34、CD44、CD49d、CD106(Sigma)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康SD大鼠，雌雄不限，按月齡分為幼年組(1月齡)、成年組(12月齡)和老年組(24月齡)。體重分別約為150、400、750g。

1.3 ADSCs的分離培養(yǎng)及傳代 取SD大鼠，脫頸處死，消毒，無(wú)菌條件下取腹股溝部及腎下1g脂肪組織，去除其他組織，用PBS沖洗3次，將脂肪組織剪成大約1mm3小塊，置2g/LⅠ型膠原酶中，消化60min，然后1000r/min，離心10min，棄上清，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，接種于培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)1∶2傳代、擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 每日在倒置顯微鏡下觀察原代及傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)情況以及形態(tài)特點(diǎn)。

1.5 ADSCs表面標(biāo)記的檢測(cè) 取第3代的ADSCs，分為4份，分別滴加兔抗鼠CD34、CD44、CD49d、CD106一抗，4℃反應(yīng)30min后，PBS洗滌2次，滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗兔IgG，避光固定，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD34、CD44、CD49d、CD106陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)。將第3代ADSCs多聚甲醛固定后，免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色鑒定。

1.6 ADSCs生長(zhǎng)周期的測(cè)定 取第3代細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)消化制成細(xì)胞懸液，滴入4℃預(yù)冷的700mL/L乙醇中固定30min，PBS漂洗離心，RNAseA處理30min，離心，加入碘化丙啶0.5mL，4℃避光染色30min，流式細(xì)胞儀488nm檢測(cè)。

1.7 繪制ADSCs的生長(zhǎng)曲線 取各年齡組ADSCs以1×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200μL，常規(guī)培養(yǎng)。每天同一時(shí)間隨機(jī)抽取6孔細(xì)胞，加入50g/L MTT 20μL/孔，培養(yǎng)4～6h，DMSO震蕩10min，酶聯(lián)免疫測(cè)定儀測(cè)定波長(zhǎng)490nm處的吸光度。取6孔吸光度的均值，以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，吸收值(A)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)采用±s表示。組間比較采用單因素方差分析，方差不齊組經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行方差分析；各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線用重復(fù)測(cè)量的方差分析(Repeatedmeasures ANOVA)。P

2 結(jié)

果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 原代培養(yǎng)ADSCs的形態(tài)學(xué)觀察 通過(guò)密度梯度離心獲得的ADSCs接種后在懸液中細(xì)胞呈圓形，不能辨認(rèn)細(xì)胞核，各年齡組在原代培養(yǎng)24h，可見細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞呈星形，胞體較小；培養(yǎng)第4天，各組細(xì)胞形態(tài)無(wú)差別，均呈梭形、多角形；幼年組細(xì)胞數(shù)量多，形成集落明顯，克隆性生長(zhǎng)(圖1A)；成年組細(xì)胞數(shù)量較多，克隆性生長(zhǎng)(圖1B)；老年組細(xì)胞數(shù)量少，散在分布(圖1C)。幼年組ADSCs大約5d左右達(dá)到80%細(xì)胞融合基本鋪滿瓶底，成年組和老年組ADSCs分別需要6、8d左右才可以達(dá)到80%細(xì)胞融合，進(jìn)行傳代。

2.1.2 傳代培養(yǎng)ADSCs的形態(tài)學(xué)觀察 各年齡組均呈現(xiàn)特征性生長(zhǎng)模式，傳代培養(yǎng)的ADSCs生長(zhǎng)模式與原代培養(yǎng)細(xì)胞相似，但細(xì)胞增殖速度比原代明顯加快(圖2)，幼年組、成年組、老年組細(xì)胞分別為3、4、5d左右傳代，ADSCs多呈短梭形。

2.2 細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè) 對(duì)各組第3代ADSCs通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了CD34、CD44、CD49d、CD106四個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記，各年齡組細(xì)胞表面CD44、CD49d陽(yáng)性表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色后胞膜為棕色，陽(yáng)性率均在95%以上；而CD34、CD106為陰性表達(dá)，胞膜未著色(圖3)。

2.3 ADSCs生長(zhǎng)周期的測(cè)定 各年齡組周期細(xì)胞所占比例見表1。老年組與成年組、幼年組相比，G0/G1期由78.77%增至88.30%；S期比例由15.23%降至8.17%，幼年組S期比例明顯高于其他組，與成年組之間的差異有顯著性意義(F0.05(1，27)=4.21

2.4 ADSCs的生長(zhǎng)曲線 各年齡組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S型。接種后1～2d為滯留期，第3天左右達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6～7天達(dá)到最高峰，此后出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制狀態(tài)，進(jìn)入平臺(tái)期，數(shù)目不再增長(zhǎng)。年齡越小細(xì)胞增殖速度越快，幼年組高峰值明顯大于其他組，但與老年組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。圖4 不同年齡段ADSCs的生長(zhǎng)曲線

3 討

論

組織工程中種子細(xì)胞的選擇至關(guān)重要。目前，主要的種子細(xì)胞有以下幾種：胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血間充質(zhì)干細(xì)胞等。胚胎干細(xì)胞雖然可以定向誘導(dǎo)分化為各種組織細(xì)胞，但是存在倫理問(wèn)題，限制了其實(shí)際應(yīng)用[5]。一般認(rèn)為BMSCs是組織工程理想的種子細(xì)胞之一，但即使在骨髓中，MSCs的含量也很低，每105～106個(gè)單核細(xì)胞中大約含一個(gè)MSCs，并且隨著增齡，MSCs含量逐漸減少[6]，并且骨髓穿刺給患者造成較大的創(chuàng)傷和痛苦，而且采集量有限，每個(gè)成人只能抽取10～20mL骨髓，因此不利于臨床大規(guī)模的培養(yǎng)與應(yīng)用。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源有限且分離困難，臨床應(yīng)用潛力較小。ADSCs證實(shí)其具有分化為多種中胚層來(lái)源細(xì)胞的潛能[7]，由于人體脂肪量較多約占體重的13%，所以ADSCs的來(lái)源十分豐富，并且自體移植可以避免排斥反應(yīng)以及許多倫理問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)中各年齡階段SD大鼠均能培養(yǎng)出ADSCs，各組細(xì)胞均呈梭形或不規(guī)則形。幼年組和成年組細(xì)胞胞體較小、集落形成較密集、形態(tài)規(guī)則、細(xì)胞密度大；老年組細(xì)胞較大并且稀疏、呈散在分布、供體形成集落小、少，幼年組以及成年組細(xì)胞提取數(shù)量明顯高于老年組。

本研究中ADSCs表面表達(dá)CD44、CD49d陽(yáng)性；而CD34、CD106為陰性表達(dá)。CD34作為造血干細(xì)胞標(biāo)志性免疫表型，CD34陰性說(shuō)明ADSCs并非來(lái)源于血液循環(huán)中的干細(xì)胞，同時(shí)說(shuō)明ADSCs未受到脂肪組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞的污染。有研究顯示ADSCs與BMSCs都可表達(dá)CD44[8]。CD49d在ADSCs中為陽(yáng)性表達(dá)，在BMSCs中則為陰性表達(dá)；而與CD106相反；本實(shí)驗(yàn)CD106陰性表達(dá)，已經(jīng)排除BMSCs污染的可能。以上結(jié)論說(shuō)明已經(jīng)得到純度較高的ADSCs。CD49d是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞定居歸巢到骨髓的表面分子，CD106是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞從骨髓中向外遷移的表面分子，CD49d與CD106是ADSCs與BMSCs很好的區(qū)別標(biāo)記，但其本質(zhì)有待進(jìn)一步的研究。

不同年齡階段的ADSCs在細(xì)胞周期各時(shí)相中的分布趨勢(shì)為G0+G1期>S期>G2+M期，說(shuō)明從幼年、成年一直到老年，大多數(shù)ADSCs處于G0+G1靜止期，各組細(xì)胞隨供體年齡增加，G0+G1靜止期百分比例不斷增加，說(shuō)明衰老使機(jī)體內(nèi)處于靜止的ADSCs數(shù)量不斷增加；S期的細(xì)胞比例反映了細(xì)胞的增殖程度，幼年組細(xì)胞處于S期的百分比例大于其他組，與其他組有顯著性差異，呈現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)而增殖期細(xì)胞減少的趨勢(shì)，說(shuō)明隨著機(jī)體的不斷衰老，干細(xì)胞增殖能力也在不斷減弱。

體外培養(yǎng)的ADSCs經(jīng)歷生長(zhǎng)滯緩期、對(duì)數(shù)增殖期和平臺(tái)期，生長(zhǎng)曲線呈S形，這符合干細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。各組均在3d左右出現(xiàn)倍增，7d左右達(dá)到增殖高峰，7d以后由于細(xì)胞已經(jīng)基本長(zhǎng)滿瓶底，出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，細(xì)胞生長(zhǎng)反而相對(duì)緩慢。由生長(zhǎng)曲線可以看出隨供體年齡的增長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖能力和活性相應(yīng)減弱。各年齡段ADSCs均可穩(wěn)定傳至9代，按支架接種細(xì)胞數(shù)106～107的要求[9]，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)后各年齡段的ADSCs的數(shù)量均可滿足臨床需要，但是應(yīng)充分考慮不同年齡段供體脂肪的抽取量以及種子細(xì)胞的擴(kuò)增時(shí)間與病情的需要。

綜上所述，明確了各年齡段從脂肪組織均可獲得ADSCs，并保持穩(wěn)定增殖力，不同年齡組經(jīng)過(guò)傳代能夠使ADSCs相對(duì)純化，并且擴(kuò)增數(shù)量能滿足臨床應(yīng)用的需要，但應(yīng)考慮年齡對(duì)ADSCs增殖的影響。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)ADSCs能夠成為組織工程中新的理想的種子細(xì)胞，并為ADSCs的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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篇3

【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞鑒定

【中圖分類號(hào)】R392.4【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1044-5511（2011）11-0346-02

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是來(lái)源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的優(yōu)點(diǎn)，是理想的組織工程種子細(xì)胞［1］具有多向分化和自我復(fù)制潛能,易于自體采集、無(wú)免疫排斥反應(yīng)、避免倫理學(xué)限制等優(yōu)點(diǎn),在細(xì)胞治療方面得到了廣泛的應(yīng)用。但是BMSCs在骨髓微環(huán)境中所占比例極少,使用何種簡(jiǎn)單操作方法快速獲取形態(tài)均一和純度較高的BMSCs便成為該研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)［2］。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法和密度梯度離心法相結(jié)合分離、純化BMSCs，通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增，以及流式細(xì)胞術(shù)鑒定，建立穩(wěn)定的BMSCs培養(yǎng)擴(kuò)增方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：日本大耳白兔4只，4周齡，雌雄不限，體重250~300g，購(gòu)于蘭州生物制品研究所。

1.2 主要試劑及儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(BB16UV型,德國(guó)Heraeus公司)、超凈工作臺(tái)(VS-1300L型,蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限責(zé)任公司)、倒置相差顯微鏡、超聲波清洗儀、純凈水系統(tǒng)、酸度計(jì)、臺(tái)式高速離心機(jī)(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)、低糖培養(yǎng)基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青鏈霉素、胰酶、流式細(xì)胞抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 兔BMSCs的采集： 取4周齡日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空針空氣栓子經(jīng)耳緣靜脈注入，待兔死亡后，將其全部浸泡于75%酒精溶液內(nèi)8~10分鐘，在無(wú)菌環(huán)境下切開前后肢皮膚，切下兔前后兩肢，剃去覆蓋于肱骨、脛骨及股骨上的肌肉組織，注意保留骨的完整性，用組織剪分離股骨、脛骨及肱骨，將其置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，縱向依次剪開各長(zhǎng)骨兩端，5ml注射器沿剪開的骨端注入L-DMEM沖洗3次，收集沖洗液約10ml，用篩網(wǎng)過(guò)濾沖洗液，加入完全低糖培養(yǎng)基重懸組織沖洗液，吸管反復(fù)吹打混勻，1000 r/ min ，4 ℃，離心 5 min ，棄去上清。再次加入適量完全低糖培養(yǎng)基，吹打混勻，分別加入一次性培養(yǎng)皿中，放入37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（圖1）。

1.4 兔 BMSCs 培養(yǎng)：1.4.1 原代 BMSCs 培養(yǎng) 向分離得到的細(xì)胞組織懸液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的 L-DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至中號(hào)塑料培養(yǎng)皿內(nèi)。將培養(yǎng)皿置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為 5 %的 CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng) 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培養(yǎng)基換液。原代培養(yǎng) 5-7 天后，細(xì)胞融合可達(dá) 80 %以上。將原代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞集落的形成和細(xì)胞形態(tài)（圖2）。

1.4.2 傳代 BMSCs 培養(yǎng) 待原代細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，F(xiàn)BS 終止消化后將細(xì)胞懸液以 1:3 比例接種于新培養(yǎng)瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培養(yǎng)基 5ml 培養(yǎng)，每隔 2 天換液，約 3-4 天后細(xì)胞可鋪滿瓶底。將傳代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。以此方法，向后傳至三代（圖3、4）。

1.5 兔 BMSCs的鑒定

對(duì)干細(xì)胞的鑒定主要是建立在對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的識(shí)別基礎(chǔ)上，采用流式細(xì)胞儀特有的細(xì)胞分析技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)精確分析出細(xì)胞表型以及其所占有的比例，使用間接標(biāo)記法標(biāo)記 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重懸，PBS 洗滌細(xì)胞 3次，向細(xì)胞懸液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀釋 1:100） 為一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗滌細(xì)胞 3 次后放入流式細(xì)胞儀中檢測(cè)。記錄數(shù)據(jù)（圖5、6）。

2 討論

BMSCs具有貼壁性、具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能、具有免疫調(diào)節(jié)功能、具有來(lái)源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，不存在免疫排斥的特性。

2.1更好地增加BMSCs的貼壁性： 在BMSCs培養(yǎng)中，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)與傳代成功與否是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。其中存在很多問(wèn)題，比如在細(xì)胞貼壁方面，用一次性塑料培養(yǎng)皿效果要優(yōu)于可重復(fù)使用的玻璃培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿。塑料培養(yǎng)皿內(nèi)壁有一層鼠尾膠原，它可以更好地促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁。

2.2 培養(yǎng)基最佳的酸堿度： 培養(yǎng)基中加碳酸氫鈉的目的，是為了在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡培養(yǎng)基中的PH值。對(duì)于GBICO的DMEM培養(yǎng)基，3.7g是對(duì)應(yīng)二氧化碳培養(yǎng)箱的二氧化碳濃度設(shè)定在10%，而5%的則對(duì)應(yīng)的是2g碳酸氫鈉。暴露在空氣中的培養(yǎng)液，因?yàn)榇髿庵卸趸嫉臐舛群艿停后w中的二氧化碳會(huì)氣體分壓高于大氣，因此會(huì)逐漸溢出，濃度逐漸降低，液體的PH值也逐漸升高，如果DMEM在空氣中存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，它將有可能變成紫紅色。一般新配置的顏色正常，在多次開蓋，培養(yǎng)液接觸空氣的時(shí)間較長(zhǎng)后，顏色會(huì)逐漸變成紫紅色，筆者的做法是，配制培養(yǎng)液時(shí)加hepes，用小容量的分裝瓶分裝，及盡量減少培養(yǎng)液與空氣的接觸時(shí)間。配培養(yǎng)基時(shí)，將酸堿度調(diào)至6.9-7.0，過(guò)濾后酸堿度會(huì)適當(dāng)增高。

2.3 傳代的注意事項(xiàng)

2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化時(shí)間：具筆者在試驗(yàn)中的觀察，在BMSCs傳代過(guò)程中，根據(jù)培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中貼壁細(xì)胞的覆蓋率確定，當(dāng)BMSCs貼壁達(dá)到80%-90%就可以傳代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞70%由原來(lái)的紡錘狀、梭形變化為橢圓形時(shí)為最佳時(shí)間，一般為1至2分鐘。

2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打時(shí)間與次數(shù) ：加入EDTA-胰酶后，靜置1分鐘，在鏡下觀察細(xì)胞變橢圓或圓形，并有輕度漂浮時(shí)，用尖吸管輕輕吹打3-6次即可。

2.3.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物： 雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物，Pittenger等認(rèn)為CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3為間充質(zhì)干細(xì)胞的重要標(biāo)志物［3］。

綜上所述，對(duì) BMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察和表型分子鑒定實(shí)驗(yàn)均證實(shí)培養(yǎng)傳代的 BMSCs 的生物學(xué)特性并未發(fā)生明顯改變，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的分離培養(yǎng)擴(kuò)增方法安全有效。本實(shí)驗(yàn)成功的建立了一系列分離、體外培養(yǎng)和擴(kuò)增兔 BMSCs 的實(shí)驗(yàn)方法，為進(jìn)一步組織工程研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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【關(guān)鍵詞】 口腔腫瘤;樹突狀細(xì)胞;表型；增殖

Biological characteristics of monocytederived dendritic cells from peripheral blood of patients with oral carcinoma

【Abstract】 AIM: To investigate the morphology， phenotype and functions of dendritic cell (DC) from peripheral blood of the healthy inpiduals and the patients with oral carcinoma. METHODS: Fifteen patients with oral carcinoma at stages of II or above were assigned to study group and 15 healthy volunteers to control group. Monocytes were isolated by density centrifugation， and cultured in the presence of GMCSF， IL4 and TNFα for 7 d in vitro. The morphological change of the cultured cells was observed by light microscopy and electron microscopy. The expressions of CD83， CD1a， CD86， CD80， HLADR were analyzed by flow cytometry. The ability of DC to stimulate the proliferation of lymphocyte in mixed lymphocyte reactions (MLR) was determined with the method of MTT. RESULTS: Morphologically and phenotypically typical DC was obtained in the 2 groups after culture for 7 d. The expression rates of CD83， CD1a on DC from the patients were 49.3±9.5 and 48.1±7.3 respectively，significantly lower than those from healthy volunteers (P0.05). Moreover， the mean fluorescence intensity of CD83， CD1a， CD80， CD86 and HLADR expressed in study group were 4.80±2.13， 3.96±1.15， 19.63±8.12， 12.33±6.75 and 39.44±7.9， respectively， which were lower but not statistically different from the control group (P>0.05). In addition， DC from the study group had the ability to stimulate the proliferation of allogeneic and autogenous lymphocytes in vitro. CONCLUSION: Monocytes in peripheral blood of the patients with oral carcinoma can be induced to differentiate into mature DC with the ability to stimulate the proliferation of lymphocytes， and so these DC might be used in immunotherapy for oral carcinoma.

【Keywords】 mouth neoplasms; dendritic cell; phenotyping; proliferation

【摘要】 目的: 研究口腔癌患者外周血樹突狀細(xì)胞(DC)的形態(tài)、表型和功能性變化及其臨床意義. 方法： 口腔癌患者（實(shí)驗(yàn)組）及正常人（對(duì)照組）15例外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)GMCSF，IL4及TNFα誘導(dǎo)培養(yǎng)， 獲取成熟DC， 光鏡和電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型如CD1a，CD83，CD80，CD86和HLADR等分子的表達(dá)變化，用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)DC與自體和同種異體的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）中對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的刺激能力. 結(jié)果： 正常人及口腔癌患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外7 d誘導(dǎo)培養(yǎng)，均誘導(dǎo)出具有典型形態(tài)和表型的DC，其中實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的CD83，CD1a表達(dá)率分別為49.3±9.5和48.1±7.3，與對(duì)照組兩者表達(dá)率62.1±7.9和60.2±6.8相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)組DC細(xì)胞CD83，CD1a，CD86，CD80和HLADR表達(dá)的平均熒光指數(shù)(MFI)分別為4.80±2.13，3.96±1.15，12.33±6.75，19.63±8.12和39.44±7.9， 均低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);口腔癌患者來(lái)源的DC在體外具有誘導(dǎo)同種異體和自體外周血T細(xì)胞增殖的能力. 結(jié)論： 口腔癌患者外周血單核細(xì)胞來(lái)源可誘導(dǎo)成為具有功能性的成熟DC，該細(xì)胞可應(yīng)用于口腔癌的免疫治療.

【關(guān)鍵詞】 口腔腫瘤;樹突狀細(xì)胞;表型；增殖

0引言

目前，對(duì)口腔癌的治療手段仍以手術(shù)為主，由于頜面部能提供的切除面積有限，有時(shí)很難實(shí)現(xiàn)距腫瘤邊緣1.5 cm清除病灶，而且手術(shù)本身造成的面部畸形嚴(yán)重破壞了患者的口腔功能和心理健康. 因此，如何縮小手術(shù)范圍、有效控制臨近亞病灶及微小病灶的發(fā)展是亟待解決的問(wèn)題. 樹突狀細(xì)胞（dendritic cells， DC）是已知功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，并被認(rèn)為是抗腫瘤免疫治療的一種非常有前途的方法［1-3］，由于DC對(duì)T細(xì)胞的活化受MHC限制，故臨床應(yīng)用的DC細(xì)胞及其疫苗必須使用腫瘤患者自身來(lái)源的DC，那么從腫瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中能否經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生出功能性DC，口腔癌患者與健康人DC細(xì)胞的表型及其抗原提呈分子的表達(dá)以及刺激淋巴細(xì)胞增殖能力有何不同，因此本研究旨在為臨床以DC為基礎(chǔ)的免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1材料和方法

1.1材料RPMI培養(yǎng)基(Hyclone USA)， 淋巴細(xì)胞分離液(上海恒生公司 )， 重組人單核巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGMCSF)，重組人白細(xì)胞介素4 (rhIL4)， 腫瘤壞死因子α(TNFα)均使用美國(guó)Peprotech Asia公司產(chǎn)品. 取200505/200510來(lái)我院口腔科住院治療的口腔癌患者15例作為實(shí)驗(yàn)組，本組病例均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)；對(duì)照組為健康志愿者15例. 兩組人員均排除感染、糖尿病、血液病和自身免疫性疾病.

1.2方法無(wú)菌采集外周血50 mL，肝素鈉抗凝. 加入等量無(wú)鈣鎂DHanks緩沖液（pH 7.4），充分混勻. 取50 mL離心管加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液20 mL后，再沿壁小心加入上述稀釋的外周血20 mL，2000 r/min， 20 min離心，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞. 小心吸取中間層細(xì)胞，用DHanks洗滌細(xì)胞3次，棄上清，用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010個(gè)/L，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3 mL. 于50 mL/L CO2，37℃條件下孵育2～3 h后，吸出培養(yǎng)上清和非貼壁細(xì)胞（用于其他實(shí)驗(yàn)），用預(yù)熱37℃的培養(yǎng)基清洗板1次，以去除非貼壁細(xì)胞，獲得貼壁的單核細(xì)胞，加入含1 MU/L rhGMCSF和0.5 MU/L rhIL4的RPMI 1640完全培養(yǎng)基于37℃ 50 mL/L CO2進(jìn)行培養(yǎng)，孵育至第5日時(shí)，每孔加入TNFα 0.2 MU/L， 7 d后得到成熟的DC［4］. 誘導(dǎo)培養(yǎng)1，3，5，7 d時(shí)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化及DC形成，在培養(yǎng)的7 d收集DC，調(diào)細(xì)胞密度為1×107/L，分為兩份，一份用10 g/L戊二醛固定30 min，梯度乙醇脫水，叔丁醇干燥，噴金，掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài). 另一份用25 g/L戊二醛固定， 鋨酸后固定， 醋酸鈉、 檸檬酸鉛雙重染色， 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu).

1.2.1FACS測(cè)定細(xì)胞表型收集體外培養(yǎng)5，7和10 d的外周血單個(gè)核細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，確定細(xì)胞活力在95%以上，分別加入直標(biāo)熒光的，如PE標(biāo)記的CD1a，CD86，HLADR，IgG1（對(duì)照），F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD83，CD80，IgG2（對(duì)照），充分均勻染色(4℃， 避光， 30 min)后FACS行細(xì)胞表型檢測(cè).

1.2.2混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)非貼壁細(xì)胞調(diào)整密度為2×109/L，加入96孔培養(yǎng)板中，分別按10∶1， 20∶1和40∶1的比例加入上述培養(yǎng)的兩組DC（保持T細(xì)胞數(shù)為105），該DC先用25 mg/L絲裂霉素于37℃孵育45 min，然后調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L，加入培養(yǎng)板各孔內(nèi)，總體積200 μL/孔，各實(shí)驗(yàn)組分設(shè)3復(fù)孔，混勻，同時(shí)設(shè)對(duì)照組. 37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)72 h. 于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)終止前4 h，加入MTT液（5 g/L） 20 μL/孔，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心培養(yǎng)板（1000 r/min， 5 min），棄上清，每孔加入DMSO（二甲基亞砜） 150 μL，充分混勻，靜置數(shù)分鐘，檢測(cè)每孔490 nm的A值，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)指數(shù)［5］. 增殖指數(shù)（SI）=試驗(yàn)孔A均值/對(duì)照孔A均值.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 采用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析; 兩組樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較用方差分析， P

2結(jié)果

2.1培養(yǎng)DC的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)人外周血貼壁細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞聚集成大小不等的細(xì)胞聚體， 3 d可見細(xì)胞聚集成團(tuán)， 少量懸浮生長(zhǎng)，部分細(xì)胞體積增大. 5 d懸浮細(xì)胞數(shù)量增多， 細(xì)胞表面有細(xì)小突起形成. 7 d懸浮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)顏色變深，有明顯樹突狀突起，掃描電鏡觀察，表面粗糙， 胞體向周圍伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起. 透射電鏡觀察， 細(xì)胞表面伸出長(zhǎng)短不一的突起， 線粒體致密化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張成池狀，溶酶體較少（圖1），呈明顯的DC細(xì)胞特征.

圖1人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d DC形態(tài)TEM ×10 000　略

2.2體外誘導(dǎo)DC細(xì)胞的表型變化人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，實(shí)驗(yàn)組（口腔癌患者）DC細(xì)胞的CD83和CD1a的表達(dá)率較對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)組DC細(xì)胞的CD83，CD1a，CD86，CD80和HLADR表達(dá)的平均熒光指數(shù)(MFI)雖然均低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1）.

表1口腔癌患者外周血DC表面分子的表達(dá)比較（略）

2.3DC對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響在自體和同種異體淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中，隨著DC比例增加，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組淋巴細(xì)胞增殖能力均明顯增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組自體AMLR增殖均值由1.8升至3.2，健康人自體AMLR增殖均值由2.2升至4.1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

圖2DC對(duì)T細(xì)胞增殖的影響　略

3討論

近年來(lái)，對(duì)實(shí)體瘤的免疫生物治療稱為腫瘤防治的研究熱點(diǎn)，免疫防御機(jī)制用于頭頸部癌的治療已顯示較好療效［6］，而DC作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職性抗原遞呈細(xì)胞（APC），能刺激未致敏T細(xì)胞的增殖和活化、啟動(dòng)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答，在腫瘤免疫治療中發(fā)揮著重要作用. 人體內(nèi)DC大多處于不成熟狀態(tài)，激活淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力較低，但具有極強(qiáng)的抗原內(nèi)吞能力. 在攝取抗原或接受某些刺激因素后DC可以分化成熟，由于體內(nèi)DC數(shù)量少而且分布廣泛，難以分離純化，怎樣通過(guò)簡(jiǎn)單有效的方法制備出大量的功能性DC來(lái)滿足臨床需要，是亟待解決的問(wèn)題.

目前，體外培養(yǎng)的DC主要來(lái)源于外周血、骨髓和臍血. 我們應(yīng)用口腔癌患者和健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)DC的產(chǎn)生. 因?yàn)橥庵苎杉椒ê?jiǎn)單易行，容易獲取，而且與骨髓相比不易污染腫瘤細(xì)胞. 研究表明，在決定DC是否可以發(fā)育成熟的調(diào)控因素中，GMCSF，IL4和TNFα是極其重要的誘導(dǎo)因子，其中GMCSF可促進(jìn)髓系細(xì)胞發(fā)育，是維持DC發(fā)育和分化的最根本的細(xì)胞因子；IL4可促進(jìn)干細(xì)胞及單核細(xì)胞分化發(fā)育成DC，并維持DC于未成熟狀態(tài)，使其具有很強(qiáng)的處理外源性抗原的能力［7］. 在DC培養(yǎng)過(guò)程中加入TNFα可以促進(jìn)DC成熟，使其具有強(qiáng)的刺激T細(xì)胞的活性，并抑制DC凋亡［8-9］.

我們對(duì)口腔癌患者及健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)GMCSF，IL4和TNFα 3種細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)分化，獲得具有典型DC細(xì)胞形態(tài)特征的DC. 經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7日時(shí)兩組DC均高表達(dá)CD86，CD80，HLADR，差異無(wú)顯著性，與文獻(xiàn)［10］報(bào)道一致. 而兩組DC之間CD83和CD1a的表達(dá)率有明顯差異. CD83是目前公認(rèn)的成熟DC標(biāo)志分子，我們考慮該差異源于兩組PBMC的貼壁率和DC轉(zhuǎn)換率不同. Onishi等［11］認(rèn)為晚期腫瘤患者的單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的DC中存在一種叫短壽命的亞群，培養(yǎng)超過(guò)7 d，較短命的亞群死亡，幸存的DC無(wú)論是表面分子表達(dá)、MLR和抗原提呈能力均與健康人相似. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，患者單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的DC在體外同樣具有激發(fā)自體和同種異體外周血T細(xì)胞增殖的作用，并且隨著DC數(shù)量的增加對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力刺激作用增強(qiáng). 我們認(rèn)為，口腔癌患者來(lái)源的MoDC在初始狀態(tài)可能與健康人有一定的免疫學(xué)差異，但是通過(guò)合理的因子組合培養(yǎng)后，同樣能發(fā)揮針對(duì)自身疾病的免疫治療作用，從而避免使用他人血源的排斥反應(yīng)，怎樣針對(duì)患者自身來(lái)源的DC特性選擇更合適的培養(yǎng)手段，發(fā)揮它的特異性免疫治療效果，尚需進(jìn)一步研究.

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篇5

【關(guān)鍵詞】 種子細(xì)胞

【Abstract】 AIM: To purify and culture human bone marrowderived endothelial progenitor cells (EPCs) in vitro and to observe their biological characteristics. METHODS: Mononuclear cells were isolated from bone marrow suspension by density gradient centrifugation and EPCs were harvested in the endothelial growth medium (EGM2). EPCs were observed under microscope， the cell growth was calculated by cell counting and the cells were identified by electronic microscope examination and immunofluorescence staining for the expression of Ⅷ/vWF， vascular endothelial growth factor receptor2 （VEGFR2）. RESULTS: The culturedishadherent EPCs uniformly had a round or spindle shape and reformed clones with cobblestone morphology. The cells could be identified by the positive staining for VEGFR2 and Ⅷ/vWF. WeibelPaladle bodies could be seen under transmission electron microscope. CONCLUSION: EPCs are one group of stem cells in the bone marrow with the capacity of differentiating into endothelial cells. They can be purified and cultured by density gradient centrifugation and subjected to culture in vitro with endothelial growth medium (EGM2 MV). These findings suggest that EPCs may be a new seed cell of tissue engineering.

【Keywords】 bone marrow; endothelium/cytology; stem cells; tissue engineering; seed cells

【摘要】 目的： 體外分離純化人骨髓內(nèi)皮前體干細(xì)胞，研究其基本生物學(xué)特性. 方法： 利用密度梯度離心法分離成人骨髓得到單個(gè)核細(xì)胞，再用內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)得到內(nèi)皮前體干細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特性，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）、Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體表達(dá)和透射電鏡對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定. 結(jié)果： 原代培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，7~10 d形成集落或融合呈卵石形，免疫組化熒光染色后結(jié)果顯示VEGFR2， Ⅷ/vWF 陽(yáng)性，透射電鏡顯示細(xì)胞內(nèi)具有特征性的WP小體. 結(jié)論： 用密度梯度離心法和條件培養(yǎng)可以從骨髓得到高純度內(nèi)皮前體干細(xì)胞，該細(xì)胞具有與血管內(nèi)皮細(xì)胞共同的特征，可以進(jìn)一步分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，是理想的組織工程種子細(xì)胞.

【關(guān)鍵詞】 骨髓；內(nèi)皮/細(xì)胞學(xué)；干細(xì)胞；組織工程；種子細(xì)胞

0引言

隨著干細(xì)胞研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮前體細(xì)胞（endothelial progenitor cells， EPCs）是具有活躍分化潛能的干細(xì)胞，具有游走特征并能進(jìn)一步增殖分化為內(nèi)皮細(xì)胞.它不僅參與胚胎期的血管發(fā)育，也存在于成年機(jī)體的骨髓和外周血中，在成體血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育中起重要作用，可以作為種子細(xì)胞用于人工血管、組織工程瓣膜內(nèi)皮化的研究與應(yīng)用［1］. EPCs的研究愈來(lái)愈受到關(guān)注，但分離相對(duì)困難，關(guān)于其培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究少見報(bào)道. 為進(jìn)一步探討EPCs作為組織工程種子細(xì)胞的可能性與優(yōu)越性，我們進(jìn)行人骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性的研究.

1材料和方法

1.1材料

骨髓取自健康志愿者. 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（EGM2， Clonetics， USA），內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充物（EGM2 MV SingleQuots， Clonetics， USA），其中包含有胎牛血清（FBS）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1）以及抗生素等，黏連蛋白（FibronectinFn，Sigma），淋巴細(xì)胞分離液與PBS液（TBD公司），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡鹽液（Gibco），VEGFR2兔抗（NeoMarkers，USA），第Ⅷ因子鼠抗(北京中山公司），二抗（FITC羊抗鼠與Cy3羊抗兔，Sigma），F(xiàn)ITCconjugated CD34鼠抗（R & D公司）.

1.2方法

1.2.1骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的分離［2］無(wú)菌條件下，取人骨髓液5 mL，加入肝素，用PBS液充分混勻，轉(zhuǎn)入離心管，輕輕地層加到1077 g/L的淋巴細(xì)胞分離液上，2000 r/min離心20 min，收集中間的單個(gè)核細(xì)胞層，用PBS液1000 r/min離心洗滌2次×10 min以洗除殘余淋巴細(xì)胞分離液，然后收集細(xì)胞備用.

1.2.2EPCs的培養(yǎng)收集骨髓中單個(gè)核細(xì)胞，用含胎牛血清和多種生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基混勻，制成細(xì)胞懸液，接種于以黏連蛋白（Fn）包被的培養(yǎng)瓶中，置37℃含50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)，第4日換液，去除非貼壁細(xì)胞，此后每3~4 d換液1次. 相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底的80%，用0.125 g/L胰酶消化，并以2×107/ L細(xì)胞數(shù)傳入24孔培養(yǎng)板中，每日取4孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并求均數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間.

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期骨髓EPCs， 以0.125 g/L胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)周期；同時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34表達(dá)，鑒定所得細(xì)胞純度.

1.2.4EPCs細(xì)胞表面抗原免疫熒光染色檢測(cè)培養(yǎng)10 d的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色，檢測(cè)細(xì)胞表面抗原VEGFR2與Ⅷ/vWF等表達(dá)情況，選取培養(yǎng)10 d的成纖維細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色作為對(duì)照組. 過(guò)程如下： 細(xì)胞片用PBS液洗，然后用40 g/L多聚甲醛常溫處理30 min，再用含50 mg/L馬血清和50 mg/L小牛血清的PBS液浸泡30 min，去除非特異性標(biāo)記，再加入VEGFR2， Ⅷ因子mAb （1∶100），37℃孵育過(guò)夜，用PBS液洗3次，加入熒光標(biāo)記二抗，37℃搖床孵育1 h，熒光顯微鏡下拍照.

1.2.5電鏡檢查體外培養(yǎng)10 d，離心收集EPCs，用3 g/L戊二醛固定過(guò)夜，細(xì)胞團(tuán)用PBS 洗3 次×10 min，1 g/L四氧化鋨4℃固定30 min， PBS洗3次×10 min，丙酮系列脫水，包埋并制作超薄切片，透射電鏡觀察拍照.

轉(zhuǎn)貼于

2結(jié)果

2.1骨髓EPCs體外培養(yǎng)及擴(kuò)增用梯度密度離心法從骨髓中分離出單個(gè)核細(xì)胞層后，用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，并通過(guò)換液去除非貼壁細(xì)胞，所得貼壁細(xì)胞即為骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞. 原代培養(yǎng)4 d內(nèi)，細(xì)胞呈圓形（Fig 1A）；培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞鋪展呈橢圓形或短梭形，并迅速增殖，10 d后出現(xiàn)細(xì)胞融合呈“鋪路卵石樣”（Fig 1B），約14 d可傳代. 傳代后細(xì)胞于24 h內(nèi)完全貼壁，接種后第1~3日為潛伏適應(yīng)期，從第4日起細(xì)胞增殖迅速并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第7日達(dá)高峰，此后進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如Fig 2所示. 同時(shí)，依據(jù)生長(zhǎng)曲線計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為36 h.

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)貼壁細(xì)胞消化后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞均一性較好（陽(yáng)性表達(dá)率72%），說(shuō)明采用本實(shí)驗(yàn)中分離細(xì)胞的方法可得到較高純度的骨髓EPCs. 同時(shí)，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)周期，結(jié)果顯示： G0/G1期細(xì)胞為71.1%，G2/M期細(xì)胞為14.7%，S期細(xì)胞為14.2%，說(shuō)明EPCs細(xì)胞增殖比較活躍.

2.3骨髓EPCs表面標(biāo)記的檢測(cè)EPCs細(xì)胞均表達(dá)Ⅷ/vWF，免疫熒光染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞胞質(zhì)呈綠色，胞核不染色（Fig 3A）；EPCs細(xì)胞均表達(dá)VEGFR2，免疫熒光染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞胞質(zhì)呈磚紅色，胞核不染色（Fig 3B）. 對(duì)照組成纖維不表達(dá)Ⅷ/vWF與VEGFR2，免疫熒光染色呈陰性，細(xì)胞胞質(zhì)和胞核均不染色.

2.4骨髓EPCs超微結(jié)構(gòu)觀察細(xì)胞邊緣可見較多絨毛狀突起，胞質(zhì)內(nèi)還見一種短棒狀小體，即Weibel Palade氏小體，是內(nèi)皮細(xì)胞特征性的細(xì)胞器（Fig 4）.

3討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，EPCs具有游走特征并能進(jìn)一步增殖分化為內(nèi)皮細(xì)胞，它不僅參與胚胎期的血管發(fā)育，也存在于成年機(jī)體的骨髓和外周血中，在成體血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育中起重要作用. 1997年Asahara等［3］成功地在體外將CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)生成血管內(nèi)皮細(xì)胞，并于體內(nèi)證明其生血管能力，說(shuō)明EPCs是CD34+細(xì)胞重要亞群. 因此，EPCs有望成為血管組織工程內(nèi)皮種子細(xì)胞的新來(lái)源.

EPCs是CD34+細(xì)胞重要亞群，多采用吸附單克隆抗體－磁珠分離系統(tǒng)(MACS)進(jìn)行分離得到，此法所得細(xì)胞均一性好，純度高，但價(jià)格昂貴，實(shí)用價(jià)值欠佳，同時(shí)，EPCs吞噬的磁性微粒也必然影響細(xì)胞的代謝及功能［4］. 本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)細(xì)胞密度的差異，針對(duì)EPCs屬于單核類細(xì)胞的特點(diǎn)，抽取骨髓后，用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞層，再利用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)條件培養(yǎng)基外加黏連蛋白黏附特性，最終所得貼壁細(xì)胞即為EPCs. 同時(shí)，我們對(duì)所得到的骨髓EPCs用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞均一性較好，CD34陽(yáng)性表達(dá)率72%，也進(jìn)一步鑒定了所得到的細(xì)胞為較高純度的骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞. 此方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效，具用較高的應(yīng)用價(jià)值.

VEGFR2是內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的早期表面受體，主要出現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的早期［5］. Ⅷ因子是內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原，可以通過(guò)vWF的測(cè)定對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定［6］. 本實(shí)驗(yàn)中人骨髓EPCs呈貼壁生長(zhǎng)，隨體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其形態(tài)由早期圓形鋪展呈橢圓形或短梭形，并迅速增殖，出現(xiàn)細(xì)胞融合呈“鋪路卵石樣”. 培養(yǎng)一定時(shí)間后，細(xì)胞增殖速度由快變慢，胞體變大、胞質(zhì)疏松，提示EPCs增殖活力下降. 原代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線顯示，EPCs的體外培養(yǎng)經(jīng)歷了生長(zhǎng)滯緩期、對(duì)數(shù)增殖期和生長(zhǎng)平臺(tái)期，其增生分裂能力活躍，體外培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增. 此外，分離得到的骨髓EPCs具有與血管內(nèi)皮細(xì)胞共同的特征，細(xì)胞呈鵝卵石狀貼壁生長(zhǎng)，均表達(dá)VEGFR2， Ⅷ/vWF，胞質(zhì)內(nèi)還可見內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記短棒狀小體，即Weibel Palade氏小體.

EPCs存在于成年機(jī)體的骨髓和外周血中，可以自體取材，避免新的機(jī)體創(chuàng)傷和免疫排斥反應(yīng). 同時(shí)，EPCs增生分裂能力活躍，體外培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增，能進(jìn)一步分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與成體血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長(zhǎng)等病理生理過(guò)程［7］. 因此，EPCs可以作為理想的內(nèi)皮種子細(xì)胞來(lái)源，用于人工血管、組織工程瓣膜內(nèi)皮化研究，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值.

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篇6

[關(guān)鍵詞]醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué) 教學(xué)改革

[中圖分類號(hào)]G622 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1009-5349（2015）12-0233-01

臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的應(yīng)用科學(xué)專業(yè)。它致力于培養(yǎng)具備基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)的基本理論和醫(yī)療預(yù)防的基本技能，能在醫(yī)療衛(wèi)生單位、醫(yī)學(xué)科研等部門從事醫(yī)療及預(yù)防、醫(yī)學(xué)科研等方面工作的醫(yī)學(xué)高級(jí)專門人才。該專業(yè)學(xué)生主要學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)方面的基礎(chǔ)理論和基本知識(shí)，人類疾病的診斷、治療、預(yù)防方面的基本訓(xùn)練。要具有對(duì)人類疾病的病因、發(fā)病機(jī)制做出分類鑒別的能力。隨著細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的相關(guān)知識(shí)和理論在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用的不斷深入，“細(xì)胞生物學(xué)”已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ)，在醫(yī)學(xué)教育中占有重要的地位。對(duì)于現(xiàn)代醫(yī)科學(xué)生來(lái)說(shuō)，具備“細(xì)胞生物學(xué)”的相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)和基本技能，是進(jìn)一步學(xué)習(xí)其他醫(yī)學(xué)課程必不可少的條件。

一、醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)課程內(nèi)容體系和結(jié)構(gòu)

我校醫(yī)學(xué)本科專業(yè)自1978年開設(shè)以來(lái)，在教育部組織的1997年、2006年本科教學(xué)工作水平評(píng)估中分別達(dá)到“優(yōu)”和“良”的水平。為內(nèi)蒙古、吉林、遼寧等全國(guó)各地區(qū)培養(yǎng)了一萬(wàn)多名合格的高級(jí)醫(yī)學(xué)專業(yè)人才，臨床專業(yè)畢業(yè)生遍布全國(guó)各省及美國(guó)、日本等國(guó)家。所招學(xué)生范圍逐年擴(kuò)大，并分為漢班和蒙班，其中蒙班學(xué)生為蒙古族，他們主要為蒙古族中小學(xué)考上來(lái)的，蒙語(yǔ)授課兼修漢語(yǔ)。

醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)以細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，是探索研究人體細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育、增殖、衰老、死亡以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的異常與人類疾病關(guān)系的學(xué)科。課程基本內(nèi)容有13章，包括細(xì)胞生物學(xué)緒論、細(xì)胞膜的化學(xué)組成與特性、細(xì)胞表面與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜的功能、細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)、線粒體、核糖體、細(xì)胞骨架、細(xì)胞核與遺傳物質(zhì)儲(chǔ)存、細(xì)胞中遺傳信息的傳遞及調(diào)控、細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞衰老與死亡。第1章，引領(lǐng)學(xué)生進(jìn)入醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)課程，指導(dǎo)學(xué)生如何學(xué)習(xí)這門課；第2―9章為基礎(chǔ)理論知識(shí)，學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)特有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能及其與疾病關(guān)系；第10―13章，主要以細(xì)胞為整體，看細(xì)胞的“一生”變化。通過(guò)這三部分的學(xué)習(xí)，能夠使學(xué)生掌握人體細(xì)胞的知識(shí)，同時(shí)把細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的異常與人類疾病關(guān)系滲透到各個(gè)章節(jié)。

二、醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與其他課程的聯(lián)系

醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)在臨床專業(yè)培養(yǎng)計(jì)劃中，大一開課，這充分體現(xiàn)了該課程的基礎(chǔ)性。其后的課程有生物化學(xué)、組織學(xué)與胚胎學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)等。組織學(xué)與胚胎學(xué)是相互關(guān)聯(lián)的兩門學(xué)科，習(xí)慣列為一門專業(yè)基礎(chǔ)課程。組織學(xué)是研究機(jī)體微細(xì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的科學(xué)。胚胎學(xué)主要是研究從受精卵發(fā)育為新生個(gè)體的過(guò)程及其機(jī)理的科學(xué)，其研究?jī)?nèi)容包括生殖細(xì)胞發(fā)生、受精、胚胎發(fā)育、胚胎與母體的關(guān)系、先天性畸形等。在其內(nèi)容中涉及細(xì)胞的知識(shí)較多，比如什么是生殖細(xì)胞、細(xì)胞分化的原理、細(xì)胞分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞等等。如果沒(méi)有學(xué)習(xí)相應(yīng)的細(xì)胞生物學(xué)課程，很難理解這些基本概念與原理。生理學(xué)是研究機(jī)體正常生命活動(dòng)規(guī)律的一門課程，學(xué)生能夠?qū)W習(xí)人體各器官的基本功能，認(rèn)識(shí)機(jī)能與結(jié)構(gòu)的聯(lián)系，理解機(jī)體的整體統(tǒng)一性及與環(huán)境的對(duì)立統(tǒng)一關(guān)系。其內(nèi)容包括細(xì)胞、組織、器官和系統(tǒng)的基本功能及功能調(diào)節(jié)。該課與細(xì)胞生物學(xué)關(guān)聯(lián)緊密，很多人體生理活動(dòng)，都是以細(xì)胞為基礎(chǔ)。比如細(xì)胞的Na-K離子泵工作原理闡釋了物質(zhì)在細(xì)胞兩側(cè)的運(yùn)輸，從而調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境滲透壓平衡。

生物化學(xué)是運(yùn)用化學(xué)的理論與方法，從分子水平研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，能夠使學(xué)生獲得生物化學(xué)的基本理論、基本知識(shí)和基本技能。其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)與核酸化學(xué)、維生素、酶、生物氧化、物質(zhì)代謝及其調(diào)節(jié)、肝臟生化和酸堿平衡等。這里提到的核酸是細(xì)胞內(nèi)的遺傳信息載體，生物氧化、物質(zhì)代謝多發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，可見，離開了細(xì)胞，生物化學(xué)這門課程將無(wú)法開展。病理學(xué)是一門研究疾病的病因、發(fā)病機(jī)制、病理改變（包括代謝、機(jī)能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變）和轉(zhuǎn)歸的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)學(xué)科。其目的是認(rèn)識(shí)和掌握疾病的本質(zhì)的發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，從而為防治疾病提供必要的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。人類很多疾病的本質(zhì)是特定細(xì)胞的損傷，比如高膽固醇血癥，主要發(fā)病原因是細(xì)胞膜上的受體缺失或無(wú)法識(shí)別供體。因此，在介紹這類疾病時(shí)，就需要掌握細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的功能等細(xì)胞生物學(xué)內(nèi)容。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究機(jī)體免疫系統(tǒng)的組織結(jié)構(gòu)和生理功能的科學(xué)，其基本定義概念如抗原、抗體，這些都是細(xì)胞內(nèi)外存在的物質(zhì)。

因此，隨著我校臨床專業(yè)培養(yǎng)計(jì)劃的改革發(fā)展，醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)必定成為必不可少的專業(yè)基礎(chǔ)課程，需要加以重視。

【參考文獻(xiàn)】

[1]呂毅，吳小健，向俊西等.抓好臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)位人才培養(yǎng)新模式試點(diǎn)工作的探討[J].西北醫(yī)學(xué)教育，2014（05）：866-868.

[2]白一，龔云輝，劉希婧等.臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)八年制醫(yī)學(xué)教育的現(xiàn)狀[J].中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志（電子版），2014（01）：113-115.

篇7

【關(guān)鍵詞】中醫(yī)；生物學(xué)；生物技術(shù)；研究

【中圖分類號(hào)】Q81 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1008-6455（2010）11-0248-02

Study of TCM bioengineeing

Ouyang Xuejian

【Abstract】From angle of TCM bioengineering probe into TCM basic theory and way of study, to basis of TCM and clinical research mean much.

【Key words】traditional chinese medicine (TCM); biology; biotechnology; study

隨著TCM的不斷創(chuàng)新，用現(xiàn)代中醫(yī)生物學(xué)的研究手段，完善TCM的基礎(chǔ)理論是必經(jīng)之路。

1生命之書

1960年首次被破譯遺傳密碼，分子生物學(xué)家對(duì)復(fù)雜的細(xì)胞分子進(jìn)行了分類。人類基因從遠(yuǎn)古到現(xiàn)代以密碼的形式表達(dá)出來(lái)，展現(xiàn)在科學(xué)家面前。常有一種誤解基因代表每個(gè)特性，這種誤解并沒(méi)有因基因測(cè)序而被消除，并被加強(qiáng)了這是因?yàn)閱位虿”挥懻揫1]，事實(shí)上許多遺傳性疾病是由多個(gè)基因以某種未知方式相互作用的結(jié)果。人類基因組的解譯，象征著思想變革的始點(diǎn)走向未來(lái)。

2生物學(xué)革命

細(xì)胞生物學(xué)革命并不是基因組的解譯，而是基因行為方式和序列間相互作用的發(fā)現(xiàn)，但必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)才能得到體現(xiàn), 即閱讀細(xì)胞故事要?dú)w功于生物學(xué)-DNA芯片[2]。它能同時(shí)觀測(cè)許多基因行為的是基因組測(cè)序。即一個(gè)細(xì)胞隨時(shí)有數(shù)千個(gè)基因開啟，它不僅開啟一個(gè)或兩個(gè)基因來(lái)完成任務(wù)，并在任務(wù)完成后再將它們關(guān)閉，但其理論的構(gòu)建并不是輕易獲得的。分子和細(xì)胞生物學(xué)[8]，簡(jiǎn)潔一流的理論很少見，蛋白質(zhì)A開啟了蛋白質(zhì)B，然后激活蛋白質(zhì)C，如果大家能理解將對(duì)研究很有幫助。生物學(xué)家并引入了物理學(xué)概念，尋找簡(jiǎn)潔一流理論，但是并不表明研究的系統(tǒng)是簡(jiǎn)潔的。物理學(xué)家設(shè)計(jì)的理論用于解釋大量分子行為，如氧的彌散在介質(zhì)的作用下，個(gè)體特性會(huì)淹沒(méi)在團(tuán)體行為的模式下?；蚝偷鞍踪|(zhì)更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗鼈儾灰苿?dòng)，不隨機(jī)相互作用，但能選擇性的參與某一功能性活動(dòng)?；瘜W(xué)提供了另一組工具，一些非生命系統(tǒng)中的化學(xué)過(guò)程與生物化學(xué)過(guò)程一樣復(fù)雜混亂，但并不妨礙被計(jì)算機(jī)模型所獲取，其結(jié)論是使復(fù)雜的模型簡(jiǎn)單化，原因是一些成分可以被忽略。

3計(jì)算機(jī)模擬藝術(shù)

它不僅分析數(shù)據(jù)也是一種重要工具。物理學(xué)家把其藝術(shù)帶入到了精密狀態(tài)，天體物理學(xué)家能模擬整個(gè)星系世界，生物學(xué)家就能模擬細(xì)胞的微觀世界。計(jì)算機(jī)模擬復(fù)雜的真實(shí)細(xì)胞，預(yù)測(cè)基因活性與細(xì)胞功能變化的基因組，并建立了數(shù)據(jù)庫(kù)。研究細(xì)胞中多種過(guò)程的比較模型，許多蛋白質(zhì)能同時(shí)催化大范圍化學(xué)反應(yīng)，不同反應(yīng)的相對(duì)重要性會(huì)因基因被激活而產(chǎn)生某種蛋白而再次關(guān)閉，來(lái)模擬整個(gè)細(xì)胞行為。工程學(xué)認(rèn)為一個(gè)細(xì)胞事件不會(huì)簡(jiǎn)單的導(dǎo)致某一事件發(fā)生，有時(shí)一個(gè)過(guò)程會(huì)影響某個(gè)過(guò)程發(fā)生，用工程學(xué)術(shù)語(yǔ)描述就是反饋。即角加速時(shí)人體向一側(cè)傾倒，此時(shí)膜半規(guī)管內(nèi)淋巴液向相反方向流動(dòng)刺壺腹嵴產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，傳至平衡中樞維持人體平衡，這就是人置與平衡中樞間的反饋，這種自我調(diào)節(jié)在工程學(xué)中十分常見。即可用“控制論”和“系統(tǒng)論”來(lái)描述它，生物學(xué)家已應(yīng)用在細(xì)胞中。描述生物學(xué)功能包含擴(kuò)大、改編、加強(qiáng)、絕緣、糾錯(cuò)和一致性檢測(cè)等概念。描述新的生物學(xué)語(yǔ)言將來(lái)源于綜合科學(xué)，即計(jì)算機(jī)科學(xué)或生物工程學(xué)等學(xué)科[3、4]。

4網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)

世界范圍互聯(lián)網(wǎng)中的信息總是最新的，那里有通信、高速公路、鐵路、航運(yùn)等，為網(wǎng)路提供能量、電流、水、物質(zhì)、友誼等，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)它們是如此相似。細(xì)胞中每一類分子都視為網(wǎng)絡(luò)的組成部分，任何兩個(gè)分子之間均有聯(lián)系，共同參與生物化學(xué)反應(yīng)，結(jié)論就是細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)與許多社會(huì)網(wǎng)絡(luò)一樣，有著相同的連通結(jié)構(gòu)。這樣的共性對(duì)于定義基因間的相互作用很有幫助，但并不是所有網(wǎng)絡(luò)都相同[5、6]，有時(shí)幾個(gè)連接破壞而迅速瓦解，有時(shí)即便有許多連接被破壞，任何兩個(gè)節(jié)點(diǎn)間仍可保持通暢，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)也是如此。理解了生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)的特點(diǎn)，為組建細(xì)胞自身系統(tǒng)對(duì)其研究奠定了基礎(chǔ)。

5生物學(xué)模塊

基因通常結(jié)隊(duì)工作當(dāng)細(xì)胞分解糖產(chǎn)生能量，激活一組基因來(lái)產(chǎn)生各自所需要的酶[7]。理論生物學(xué)家提示如果能夠找出這類“聯(lián)合作業(yè)”，并將其視為獨(dú)立分子來(lái)理解細(xì)胞的復(fù)雜活動(dòng)。即一部分制造蛋白質(zhì)，一部分復(fù)制細(xì)胞分裂的DNA，其他部分對(duì)特殊的酶做出響應(yīng)等等。但這些分子不是基因簡(jiǎn)單的組合,它們包括了蛋白質(zhì)，RNA小信號(hào)分子和富含能量的分子，即酶等共同執(zhí)行其功能, 蛋白質(zhì)組學(xué)顯示了它的特殊貢獻(xiàn)。即細(xì)胞分裂模塊包裹在膜內(nèi)，如線粒體是能量的“工廠”。就像組建大樓一樣，模塊之間通過(guò)一類或幾類介質(zhì)分子相互聯(lián)系，各部門備有“辦公室備忘錄”這就解決了每個(gè)突發(fā)件事的需要。可想象設(shè)計(jì)一種更精密的特定模塊，其小部分分子間相互作用的模塊延伸到整個(gè)細(xì)胞。模塊的功能來(lái)自其他模塊一部分輸入，并產(chǎn)生輸出影響其他模塊。其集體行為的概念類似于生物物理學(xué)概念，能表現(xiàn)模塊的特性。即模塊大部分功能特征，來(lái)自于潛在成分的特征與它們之間相互作用集合的特征。這對(duì)于生物學(xué)家來(lái)說(shuō)是陌生的，但將來(lái)會(huì)習(xí)慣這樣的描述。

6TCM生物學(xué)

TCM生物學(xué)家用生物學(xué)微觀實(shí)驗(yàn)手段，即分子與細(xì)胞生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)工程、生物學(xué)工程、生物物理學(xué)等[8-11]，模擬與解釋TCM的基本理論。需要生物工程、網(wǎng)絡(luò)工程與程序工程等共同參與形成綜合性科學(xué)。TCM把“天體”對(duì)生物體的影響都考慮進(jìn)去了，在疾病診治基本原則的基礎(chǔ)上還考慮了季節(jié)變化。即冬天益氣活血，溫腎助陽(yáng)；春天滋陰潤(rùn)肺，滋腎柔肝；夏天養(yǎng)心安神，清熱解毒；秋天健脾溫腎，滋陰補(bǔ)血。TCM早已認(rèn)識(shí)到天體變化對(duì)人體的影響，并應(yīng)用在臨床實(shí)踐中。至于經(jīng)絡(luò)到底是什么還沒(méi)有誰(shuí)在人體內(nèi)剖析出來(lái)，但臨床工作中銀針證實(shí)了它的存在，并以唯物主義的客觀事實(shí)傳承下來(lái)，如何完善它是今后研究的方向。

7TCM診療技術(shù)

TCM的基礎(chǔ)理論與臨床診療技術(shù)是根本，特別是中草藥、民間醫(yī)學(xué)很多精髓尚未開發(fā)。如西醫(yī)治療感冒居高不下的體溫(40℃)什么手段都用上了，TCM一付湯藥就能控制體溫即治愈。腫瘤壓迫所致的面神經(jīng)麻痹，TCM不用開刀減壓針灸就能矯正，這說(shuō)出來(lái)好象不可思議但TCM做到了，TCM就是這么神氣有待進(jìn)一步挖掘。TCM不僅應(yīng)懂得自身的基礎(chǔ)理論，并從生物學(xué)角度解釋出來(lái)，讓世人相信TCM接受TCM，讓TCM走向世界。

參考文獻(xiàn)

篇8

【關(guān)鍵詞】糧食深加工 生物 教學(xué) 課程建設(shè)

【中圖分類號(hào)】G642 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-4810（2013）22-0005-02

糧食深加工專業(yè)，是以發(fā)酵工程和酶工程等生物技術(shù)為專業(yè)知識(shí)基礎(chǔ)，以淀粉水解制品及其衍生物、氨基酸等淀粉發(fā)酵制品、變性淀粉等加工技術(shù)方面的知識(shí)和能力培養(yǎng)為主的學(xué)科。生物基礎(chǔ)課程教學(xué)始終著眼于專業(yè)發(fā)展的前沿性和應(yīng)用性，把培養(yǎng)高素質(zhì)應(yīng)用型人才作為教學(xué)目標(biāo)。

一 創(chuàng)新教學(xué)理念，明確教學(xué)目標(biāo)

教學(xué)理念是人們對(duì)教學(xué)和學(xué)習(xí)活動(dòng)內(nèi)在規(guī)律的認(rèn)識(shí)的集中體現(xiàn)，同時(shí)也是人們對(duì)教學(xué)活動(dòng)持有的基本態(tài)度和觀念，是人們從事教學(xué)活動(dòng)的信念。教學(xué)理念對(duì)教學(xué)活動(dòng)有著極其重要的指導(dǎo)意義。

我校堅(jiān)持把提高人才培養(yǎng)質(zhì)量作為教學(xué)工作的核心內(nèi)容，目標(biāo)是根據(jù)吉林省糧食經(jīng)濟(jì)的特色與發(fā)展對(duì)人才的客觀需求，培養(yǎng)具備所從事專業(yè)的基本理論知識(shí)，能在生物技術(shù)與工程領(lǐng)域從事設(shè)計(jì)、生產(chǎn)管理和新技術(shù)研究、新產(chǎn)品開發(fā)的技術(shù)應(yīng)用型專門人才。在重視學(xué)生的智力品質(zhì)的同時(shí)還強(qiáng)調(diào)學(xué)生良好的非智力品質(zhì)的培養(yǎng)，重視學(xué)生的創(chuàng)新精神以及在實(shí)踐中解決問(wèn)題的能力。在教學(xué)中注重內(nèi)容的基礎(chǔ)性與先進(jìn)性的有機(jī)結(jié)合，把該領(lǐng)域的最新成果和亟待解決的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題融化到教學(xué)內(nèi)容中，充分體現(xiàn)學(xué)科教學(xué)內(nèi)容的先進(jìn)性，緊跟學(xué)科發(fā)展的步伐，增強(qiáng)學(xué)生對(duì)課程的學(xué)習(xí)興趣。

二 調(diào)整課程結(jié)構(gòu)，優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容

第一，糧食深加工專業(yè)有生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等多門重要的專業(yè)基礎(chǔ)課，內(nèi)容互有交叉、重復(fù)。如何處理好它們之間的邏輯關(guān)系，搞好教學(xué)銜接是教學(xué)實(shí)踐中的一個(gè)難題。為了更好地體現(xiàn)相關(guān)課程核心內(nèi)容，我院進(jìn)行大膽取舍，使課程內(nèi)容更加精簡(jiǎn)、重點(diǎn)更加突出。如蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)都有涉及；再如對(duì)有關(guān)淀粉知識(shí)，生化教材和淀粉工藝教材等都做了審慎合理的處理。根據(jù)學(xué)生和學(xué)校的實(shí)際，堅(jiān)持基礎(chǔ)實(shí)、起點(diǎn)高、內(nèi)容新、知識(shí)活的原則，注意處理好基礎(chǔ)、前沿和能力三方面的關(guān)系。

第二，圍繞課程的教學(xué)理念，將基礎(chǔ)理論知識(shí)與學(xué)科前沿發(fā)展相結(jié)合。在理論課中適當(dāng)?shù)匾胍恍┛萍记把刂R(shí)，重視相關(guān)的科學(xué)發(fā)展史的介紹，包括學(xué)科的研究歷史、科學(xué)家的成長(zhǎng)經(jīng)歷，相關(guān)的最新科研成果，如生化課程中在講授糖化學(xué)時(shí)，補(bǔ)充介紹相關(guān)的諾貝爾獎(jiǎng)內(nèi)容、科學(xué)家生平及所做的貢獻(xiàn)，從中學(xué)習(xí)前輩的科學(xué)態(tài)度、思維方式，拓展學(xué)生視野，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和積極性， 改善教學(xué)效果。

三 尊重教育規(guī)律，重視教學(xué)法研究

好的教學(xué)方法是生物教學(xué)的有力保障。在教學(xué)過(guò)程中可以采取啟發(fā)式、互動(dòng)式、研討式的教學(xué)方法，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)主動(dòng)性，引導(dǎo)學(xué)生積極思考，主動(dòng)參與教學(xué)活動(dòng)。過(guò)去許多教師的教學(xué)只是單純以傳授學(xué)科知識(shí)為主，把教材上的全部?jī)?nèi)容“兜給”學(xué)生，學(xué)生們疲于被動(dòng)地接受一大堆結(jié)論，而不知道這些結(jié)論是如何獲取的，這種教學(xué)模式不利于學(xué)生科學(xué)思維能力的提升，因而在重視傳授基礎(chǔ)知識(shí)的同時(shí)更要重視教給學(xué)生獲得科學(xué)結(jié)論的思路和方法。

在教學(xué)中可以組織課堂討論，安排學(xué)生選擇某個(gè)專題制作PPT，進(jìn)行課堂小講座，促進(jìn)了學(xué)生之間及學(xué)生與教師之間的專業(yè)交流，培養(yǎng)了學(xué)生查閱文獻(xiàn)、閱讀文獻(xiàn)的能力，學(xué)生自學(xué)能力、演講交流能力明顯提高。教學(xué)中積累的這些素材和經(jīng)驗(yàn)，還促進(jìn)了整個(gè)專業(yè)基礎(chǔ)課程的教學(xué)，使更多的學(xué)生從中受益。

四 理論與實(shí)驗(yàn)并重，提高學(xué)生動(dòng)手能力

生物學(xué)是實(shí)驗(yàn)性很強(qiáng)的學(xué)科，實(shí)驗(yàn)課對(duì)學(xué)習(xí)生物基礎(chǔ)十分重要。我們十分注重理論教學(xué)與實(shí)驗(yàn)教學(xué)有機(jī)結(jié)合。教學(xué)中既有傳統(tǒng)的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，用于幫助學(xué)生理解、鞏固所學(xué)的生物知識(shí)，更多的是探究性實(shí)驗(yàn)，即只給出課題研究的要求，在教師指導(dǎo)下，由學(xué)生自己思考實(shí)驗(yàn)原理、選擇實(shí)驗(yàn)儀器、制訂實(shí)驗(yàn)方案，其目的重在培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)態(tài)度、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)和團(tuán)結(jié)協(xié)作的精神，促進(jìn)學(xué)生創(chuàng)新能力的提升。我們還通過(guò)開放實(shí)驗(yàn)室，創(chuàng)造條件讓學(xué)生多動(dòng)手，培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐能力。今年，生化實(shí)驗(yàn)教師指導(dǎo)的學(xué)生在吉林省高校生化技能競(jìng)賽中榮獲一等獎(jiǎng)。

五 搞好教學(xué)評(píng)價(jià)，促進(jìn)教學(xué)質(zhì)量提高

教學(xué)評(píng)價(jià)作為教學(xué)系統(tǒng)的重要組成部分，它的內(nèi)容和形式對(duì)教學(xué)活動(dòng)的開展起著重要的促進(jìn)作用。通過(guò)學(xué)校、學(xué)院、教研室和授課班級(jí)的教學(xué)管理體系，開展教學(xué)質(zhì)量監(jiān)控，對(duì)任課教師的教學(xué)質(zhì)量做出相應(yīng)的評(píng)價(jià)，建立健全教學(xué)質(zhì)量監(jiān)控體系。一是教師評(píng)學(xué)，教師通過(guò)考勤、課堂討論、作業(yè)等對(duì)學(xué)生學(xué)習(xí)過(guò)程進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)期中、期末考試進(jìn)行終結(jié)性評(píng)價(jià)；二是學(xué)生評(píng)學(xué)，學(xué)生通過(guò)網(wǎng)絡(luò)評(píng)教對(duì)教學(xué)過(guò)程提供反饋意見，了解教師教學(xué)活動(dòng)的效果；三是督導(dǎo)評(píng)學(xué)，通過(guò)學(xué)院各級(jí)督導(dǎo)對(duì)教師的課堂教學(xué)和學(xué)生的課堂學(xué)習(xí)情況進(jìn)行檢查指導(dǎo)，以此評(píng)價(jià)教師和學(xué)生的表現(xiàn)；四是實(shí)踐評(píng)學(xué)，注重將理論知識(shí)和實(shí)踐相結(jié)合，通過(guò)實(shí)驗(yàn)參與和操作過(guò)程，對(duì)教師和學(xué)生能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

專業(yè)基礎(chǔ)課教學(xué)是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，需要持續(xù)不斷的探索，努力開拓創(chuàng)新，以培養(yǎng)更多基礎(chǔ)扎實(shí)、素質(zhì)高、能力強(qiáng)、能為我國(guó)的經(jīng)濟(jì)建設(shè)和社會(huì)發(fā)展做出貢獻(xiàn)的人才。

參考文獻(xiàn)

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[2]康潔、馬麗.細(xì)胞生物學(xué)課程體系和教學(xué)模式的改革與探討[J].讀與寫，2011（11）

篇9

關(guān)鍵詞 組織工程骨；力學(xué)刺激；動(dòng)態(tài)載荷

中圖分類號(hào)R31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào) 1674-6708（2013）83-0102-02

1 概述

大段骨缺損的修復(fù)重建一直是骨科領(lǐng)域中亟待解決的難題，隨著研究的深入，其治療方法逐步從傳統(tǒng)的自體骨和異體骨移植等治療手段深入到組織工程、人工骨材料、基因工程領(lǐng)域。在體外構(gòu)建組織工程化活性骨有望成為解決上述難題的一種有效方法[1]。組織工程骨的傳統(tǒng)構(gòu)建方法是在體外將具有成骨分化能力的種子細(xì)胞與三維骨支架材料靜態(tài)復(fù)合培養(yǎng)一定時(shí)間后，植入體內(nèi)修復(fù)骨缺損。在靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下，由于重力作用造成三維支架內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量不足，分布不均勻；而且在人體內(nèi)，細(xì)胞是生長(zhǎng)在機(jī)體提供的微動(dòng)力學(xué)環(huán)境中，因此靜態(tài)培養(yǎng)無(wú)法滿足組織工程骨構(gòu)建的要求[2]。研究表明力學(xué)刺激能促進(jìn)成骨和骨再生，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能的重要因素。因而組織工程骨的培養(yǎng)需要提供適宜的壓應(yīng)力刺激，適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激能誘導(dǎo)和促進(jìn)種子細(xì)胞增殖、增加生長(zhǎng)因子分泌和細(xì)胞外基質(zhì)合成。因此采用三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)取代傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方法己經(jīng)成為組織工程骨體外構(gòu)建的一種新趨勢(shì)[3]。

為了更好地進(jìn)行組織工程骨的培養(yǎng)與骨生物力學(xué)的研究，我們對(duì)前期已研制出的組織工程骨動(dòng)態(tài)載荷培養(yǎng)裝置進(jìn)行改進(jìn)，設(shè)計(jì)建立了一套新型的動(dòng)態(tài)載荷培養(yǎng)裝置。新裝置不僅能提供良好的三維培養(yǎng)條件，而且能在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行精確的力學(xué)刺激和檢測(cè)工作，為下一步在體外進(jìn)行組織工程骨的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)和探討力學(xué)刺激對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響提供一種可靠的培養(yǎng)裝置與研究平臺(tái)。

2 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

2.1 設(shè)計(jì)原理

新、舊裝置的設(shè)計(jì)原理基本相同：通過(guò)電機(jī)驅(qū)動(dòng)加載壓頭對(duì)種子細(xì)胞—三維骨支架復(fù)合材料進(jìn)行壓應(yīng)力刺激，使之作用于附著在支架上的細(xì)胞。整個(gè)裝置由驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、控制系統(tǒng)和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)組成。

2.2 驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

新裝置驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)主要由上橫梁、中橫梁、下橫梁、滾珠絲桿、減速機(jī)構(gòu)、伺服電機(jī)及驅(qū)動(dòng)器組成。伺服電機(jī)通過(guò)連軸器與滾珠絲杠連接，電機(jī)旋轉(zhuǎn)動(dòng)作通過(guò)滾珠絲杠和絲杠螺母轉(zhuǎn)換為直線運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生周期性的垂直位移運(yùn)動(dòng)。通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件編程設(shè)定所需的頻率、位移、波形（方波、正弦波、三角波）和工作時(shí)間，伺服電機(jī)接收到控制指令后產(chǎn)生響應(yīng)頻率、波形和位移的電信號(hào)，并轉(zhuǎn)化為加載壓頭端的垂直位移，最后作用到三維骨支架上產(chǎn)生應(yīng)力刺激。實(shí)際工作信號(hào)通過(guò)位移傳感器采集反饋，在操作界面實(shí)時(shí)顯示所采集到的頻率、波形、位移和工作時(shí)間等。驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)的輸出頻率為0Hz~10Hz，加載壓頭端產(chǎn)生的壓縮位移為0mm~5mm，精確度達(dá)到0.01mm。與舊儀器相比，新裝置的位移可控精度更高，采集數(shù)據(jù)量大、準(zhǔn)確。

2.3 控制系統(tǒng)

控制系統(tǒng)分為測(cè)試控制單元和微機(jī)控制單元。測(cè)試控制單元主要有傳感器、數(shù)字控制器及功率放大器等組成。由負(fù)荷傳感器、位移傳感器和變形傳感器將其相應(yīng)的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑷醯碾娦盘?hào)，經(jīng)放大、A/D轉(zhuǎn)換、接口器將載荷、位移和變形等量轉(zhuǎn)換為數(shù)字量。微機(jī)控制單元通過(guò)編制的軟件，采集數(shù)據(jù)、繪制曲線，按操作界面設(shè)定的頻率、位移、波形以及工作時(shí)間等指令執(zhí)行，并將產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)壓縮載荷傳遞到三維骨支架表面上，及時(shí)記錄實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)、實(shí)際工作頻率和時(shí)間。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

舊裝置中細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是開放式的培養(yǎng)環(huán)境，力學(xué)加載裝置和培養(yǎng)系統(tǒng)是放置在一個(gè)超凈工作臺(tái)內(nèi)，以特制的紅外線石英加熱燈泡作為熱源，通過(guò)直接輻射加熱達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度環(huán)境。但這種方法無(wú)法保證溫度的恒定、增加了光照對(duì)細(xì)胞的影響因素，而且無(wú)法提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的濕度和CO2濃度的要求。新裝置改進(jìn)后，縮小了力學(xué)加載裝置，將其和培養(yǎng)系統(tǒng)一起可直接放入37℃、5% CO2的恒溫箱內(nèi)。舊裝置中的細(xì)胞培養(yǎng)器是用聚乙烯材料制成的。由于聚乙烯彈性模量較低，當(dāng)機(jī)械載荷作用于三維支架時(shí)，聚乙烯培養(yǎng)器會(huì)隨著三維支架一起產(chǎn)生形變，造成較大試驗(yàn)誤差。新裝置采用聚四氟乙烯材料，彈性模量高，減少了實(shí)驗(yàn)誤差，而且耐腐蝕，耐高低溫，易清洗，適于細(xì)胞培養(yǎng)。放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)部分均可以通過(guò)75%酒精擦拭以及紫外燈照射消毒，避免污染。

2.5 裝置配套工具

由于對(duì)三維骨支架材料施加的力學(xué)刺激屬于微小應(yīng)變，如果骨組織支架形狀不規(guī)則即使通過(guò)預(yù)加載也無(wú)法確保加載壓頭與支架完全緊密接觸，這將影響到應(yīng)變加載在骨組織支架上的力分布，同時(shí)各組材料也缺乏可比性。因此必須對(duì)支架材料進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的切割。我們首先采用直徑10mm的取芯電鉆，將骨組織材料制成10mm直徑大小的圓柱體，然后用線鋸將骨組織材料切割成表面平整的樣本[4]。通過(guò)這套工具制作的支架形態(tài)大小一致而且表面光滑平整。

3 討論

骨組織工程化培養(yǎng)必須有合適的力學(xué)環(huán)境，采用動(dòng)態(tài)培養(yǎng)取代傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方法已經(jīng)成為一種新趨勢(shì)。目前代表性的組織工程骨生物反應(yīng)器主要有旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器、攪拌式生物反應(yīng)器、灌流式生物反應(yīng)器和應(yīng)力加載式生物反應(yīng)器等。如何控制好反應(yīng)器內(nèi)產(chǎn)生的仿生力學(xué)環(huán)境是生物反應(yīng)器研發(fā)過(guò)程中的技術(shù)難點(diǎn)之一[4]。本研究介紹的加載裝置在原有基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步的改進(jìn)，本裝置操作簡(jiǎn)便可靠、控制精度高、壓應(yīng)變均一、滿足生物力學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)要求，不易發(fā)生污染，可望用于研究三維培養(yǎng)條件下力學(xué)載荷對(duì)成骨細(xì)胞的生物行為的影響和在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下構(gòu)建具有臨床應(yīng)用價(jià)值的組織工程骨。

參考文獻(xiàn)

[1]祝聯(lián)，鄒成，朱敏，等.組織工程化骨修復(fù)四肢骨缺損的初步臨床研究.組織工程與重建外科雜志，2009，5：121-124.

[2]張玉龍，秦廷武，楊志明.一種改進(jìn)型動(dòng)態(tài)應(yīng)變?nèi)S細(xì)胞培養(yǎng)裝置的研制.生物醫(yī)學(xué)工程研究，2008，27(4)：248-250.

篇10

關(guān)鍵詞：草履蟲；水體監(jiān)測(cè)；重金屬離子；農(nóng)藥

中圖分類號(hào)： Q959.117 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20150940002

引言

20世紀(jì)中葉以來(lái)，世界工廠化的生產(chǎn)模式不斷擴(kuò)大，人口總量迅速增加，人們對(duì)于自然資源的索取超過(guò)了自然界的再生能力，同時(shí)過(guò)度排放污染物，造成了世界性的資源短缺和嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。水污染就是其中之一。水污染可分為兩類：一類是自然污染；另一類是人為污染。其中人為污染較為常見，每年排入江河湖海的污水約有4.2×1012m3，污染了數(shù)億立方米的淡水，相當(dāng)于世界江流總量的14%以上[1]。特別是近年來(lái)，隨著農(nóng)藥的大量使用以及工廠排放廢水的增加，水污染問(wèn)題變得愈發(fā)嚴(yán)重。而水是生命的源泉，是人類賴以生存和發(fā)展的不可或缺的最重要的物質(zhì)之一，所以有效的進(jìn)行水體污染監(jiān)測(cè)刻不容緩。

草履蟲（Paramecium）是原生動(dòng)物門纖毛綱的代表物種，除了具有靈敏的應(yīng)激系統(tǒng)外，還具有分布廣泛，結(jié)構(gòu)典型，繁殖速度快，便于觀察，容易采集培養(yǎng)等特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于水體監(jiān)測(cè)[2]。目前，國(guó)內(nèi)研究人員從重金屬離子、農(nóng)藥等污染物質(zhì)對(duì)草履蟲應(yīng)激性及其生殖能力的影響等方面做了大量的研究，研究表明重金屬離子、農(nóng)藥等因素對(duì)草履蟲均會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)程度的影響[3]。

1 草履蟲簡(jiǎn)介

1.1 草履蟲種類

草履蟲是原生動(dòng)物門纖毛綱的單細(xì)胞動(dòng)物，其形狀類似于倒置草鞋底，主要生活在有機(jī)質(zhì)充足、細(xì)菌豐富、光線充足的河流池塘或水溝中。目前，世界已知草履蟲種類有22種[4]，常見的有大草履蟲、雙小核草履蟲、多小核草履蟲、綠草履蟲。其中大草履蟲最為常見，體長(zhǎng)180～300μm；雙小核草履蟲，體長(zhǎng)80～170μm，伸縮泡2個(gè)，有2個(gè)很小的小核；多小核草履蟲，體長(zhǎng)180～310μm，有時(shí)有3個(gè)伸縮泡，小核泡型，有3～12個(gè)；綠草履蟲，體長(zhǎng)80～150μm，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有綠藻共生，經(jīng)見光處培養(yǎng)后通體呈綠色，小核2個(gè)。

1.2 草履蟲的結(jié)構(gòu)

草履蟲一般呈長(zhǎng)橢圓形，前端較圓，后端寬而略尖，因形狀與草鞋相似而得名。其表膜由三層膜組成，具有緩沖和保護(hù)作用。膜下機(jī)體中生長(zhǎng)有近萬(wàn)根纖毛，其排列成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，更有助于控制草履蟲活動(dòng)[5]。與表膜垂直排列分布在外質(zhì)中的一排小桿狀的囊泡結(jié)構(gòu)，叫做刺絲泡，從而起到防衛(wèi)和捕食作用。刺絲泡在表膜上開口，蟲體在受到外界的刺激時(shí)會(huì)射出刺絲泡中的內(nèi)容物，當(dāng)內(nèi)容物接觸到水就會(huì)形成細(xì)絲[6]。

1.3 草履蟲的生活環(huán)境

草履蟲生活在水流緩慢、帶有腐草的水溝、池塘和稻田中，在有機(jī)質(zhì)豐富、光線充足的水面附近較常見，尤其是在細(xì)菌豐富的水中，草履蟲種群密度最大[7]。草履蟲在水溫0～30℃情況下均能正常生活，24～27℃是草履蟲生活的最佳水溫，當(dāng)水溫低于10℃或高于35 ℃不利于草履蟲的繁殖[8]。

1.4 草履蟲的應(yīng)激性

草履蟲細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部的水分約占細(xì)胞質(zhì)的75%～85% [9]，采取自旋回波測(cè)量的方式對(duì)草履蟲細(xì)胞進(jìn)行研究，其研究結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)的水呈“結(jié)構(gòu)化”，即草履蟲細(xì)胞內(nèi)的水是以液晶態(tài)形式存在。液晶態(tài)物質(zhì)具有對(duì)熱、磁、光、電、聲、輻射、應(yīng)力等變化反應(yīng)較靈敏的特性。所有包括膜電位在內(nèi)的應(yīng)激信息，都會(huì)通過(guò)其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)傳導(dǎo)，構(gòu)成草履蟲身體內(nèi)的原始應(yīng)激系統(tǒng)。由于草履蟲應(yīng)激系統(tǒng)靈敏的特性，使得草履蟲無(wú)論是在監(jiān)測(cè)農(nóng)藥使用的安全性方面還是重金屬離子的監(jiān)測(cè)方面都有著十分重要的意義。

2 草履蟲在水體監(jiān)測(cè)中的作用

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，工業(yè)化的迅速擴(kuò)張，人們?cè)诿鎸?duì)這一時(shí)代到來(lái)的同時(shí)，還面對(duì)著重金屬排放和農(nóng)藥過(guò)度使用所導(dǎo)致的水污染問(wèn)題。而草履蟲的應(yīng)激性能夠直觀的反應(yīng)水體污染程度，是水體監(jiān)測(cè)中的一種重要的原生動(dòng)物。

2.1 重金屬對(duì)草履蟲的影響

2.1.1 Cd2+對(duì)草履蟲的影響

重金屬鎘對(duì)生物和人體均有毒害作用，同時(shí)它也是一種水體污染物。由于草履蟲等原生動(dòng)物對(duì)鎘的毒性作用反應(yīng)同后生動(dòng)物相比更加敏感，因此草履蟲在監(jiān)測(cè)Cd2+毒性方面具有重要的意義。方衛(wèi)飛等[10]利用CdSO4、CdCl2、Cd（NO3）2這三種鎘化合物對(duì)草履蟲的生物毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明對(duì)草履蟲毒性作用最大的是CdSO4。胡好遠(yuǎn)等[11]通過(guò)對(duì)Cd2+24h半致死濃度（LC50）進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，Cd2+的濃度增加，草履蟲的種群數(shù)量也會(huì)隨之增長(zhǎng)，但Cd2+濃度過(guò)高也會(huì)降低草履蟲的種群增長(zhǎng)率。

2.1.2 Pb、Cu對(duì)草履蟲的影響

近些年來(lái)，隨著冶金工業(yè)的快速發(fā)展，部分水體中的沉積物中Pb2+、Cu2+的含量不斷積累，Pb、Cu等元素會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞，尤其是隨著雨水的沖淋，Pb、Cu等元素進(jìn)入水體環(huán)境，造成嚴(yán)重的水體污染。周玉[12]通過(guò)在20℃培養(yǎng)條件下Pb、Cu等單一元素對(duì)草履蟲種群毒性的影響的研究，結(jié)果表明，Cu2+、Pb2+24h對(duì)草履蟲的LC50分別為0.0826mg/L、3.9907mg/L；Pb、Cu等單一元素對(duì)草履蟲都具有毒害作用，且相同條件下Cu2+對(duì)草履蟲的毒害作用大于Pb2+。

2.2 農(nóng)藥對(duì)草履蟲的影響

2.2.1 除草劑對(duì)草履蟲的影響

2，4-D丁酯是除草劑中的一種，2，4-D丁酯對(duì)草履蟲的種群增長(zhǎng)具有抑制作用，但對(duì)草履蟲的細(xì)胞脅迫變化并不顯著。谷艷芳等[13]發(fā)現(xiàn)，在水環(huán)境中，草履蟲對(duì)2， 4-D丁酯有明顯的驅(qū)避作用。捕食行為受到影響會(huì)造成生物機(jī)體獲得資源減少，引起生產(chǎn)量下降或發(fā)育繁殖遲緩。所以受到2，4-D丁酯的脅迫會(huì)引起草履蟲在自然界的自然增長(zhǎng)率下降和分布格局的變化。但目前關(guān)于2， 4-D丁酯對(duì)草履蟲影響的生態(tài)毒理學(xué)機(jī)制仍不完善，需要進(jìn)一步提高。

2.2.2 殺蟲劑對(duì)草履蟲的影響

氯氰菊酯是一種廣譜、生物活性較高的擬除蟲菊酯類殺蟲劑，擁有8個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，其中有4個(gè)生物活性較高的異構(gòu)體組成的外消旋混合物稱為高效氯氰菊酯，在十字花科蔬菜、棉花、果樹、茶樹等作物害蟲的防治中應(yīng)用廣泛[14]。目前，關(guān)于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對(duì)草履蟲的毒性研究已有報(bào)道。對(duì)于氰戊菊酯對(duì)原生動(dòng)物群落48h急性毒性的檢測(cè)，王莉霞等[15]研究得出LC50為15.830mg/L。李霖等[16]通過(guò)三氟氯氰菊酯對(duì)草履蟲的毒性進(jìn)行研究，研究表明：三氟氯氰菊酯對(duì)草履蟲1h的LC50為1.650mg/L。而高效氯氰菊酯對(duì)草履蟲1h 的LC50為27.536mg/L，可見草履蟲對(duì)高效氯氰菊酯的反應(yīng)靈敏度遠(yuǎn)低于三氟氯氰菊酯。

2.2.3 殺菌劑對(duì)草履蟲的影響

多菌靈是一種廣譜性的苯并咪唑類殺菌劑，學(xué)名2-苯并咪唑基氨基甲酸甲酯（MBC），又稱作棉萎靈、苯井咪唑44號(hào)。對(duì)由半知菌、多子囊菌引起的多種作物病害有防治效果[17]。在葉面噴霧、種子處理和土壤處理中有很多應(yīng)用。李霖等[18]在進(jìn)行殺菌劑多菌靈對(duì)草履蟲的急慢性毒性作用研究，結(jié)果表明，草履蟲的生長(zhǎng)與多菌靈溶液的濃度有關(guān)，多菌靈濃度越高，毒性作用越大。

2.2.4 草履用于水體監(jiān)測(cè)的優(yōu)勢(shì)

草履蟲對(duì)毒性的應(yīng)激反應(yīng)與多細(xì)胞動(dòng)物相比更為敏銳，并且對(duì)于反映環(huán)境化學(xué)毒性物質(zhì)的毒理效應(yīng)相比單純的化學(xué)手段也更為生動(dòng)、直觀。因此，草履蟲在毒性監(jiān)測(cè)方面具有著重要的研究?jī)r(jià)值。同時(shí)草履蟲更是一種良好的水體監(jiān)測(cè)材料，是水體質(zhì)量監(jiān)測(cè)的重要指示生物之一。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員以草履蟲為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)，研究水體環(huán)境中的重金屬污染和農(nóng)藥污染等問(wèn)題，為農(nóng)藥的使用安全、重金屬污染的監(jiān)測(cè)以及生態(tài)環(huán)境保護(hù)等方面提供了更多有價(jià)值的參考。

3 問(wèn)題與展望

目前關(guān)于草履蟲的毒理研究很多，并且對(duì)于草履蟲在環(huán)境方面的監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。而在實(shí)驗(yàn)室和水體污染監(jiān)測(cè)中采用的草履蟲基本是從野外采集回來(lái)，進(jìn)行簡(jiǎn)單純化培養(yǎng)，完全達(dá)不到模式生物的要求標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于從不同水體中采集的草履蟲，因?yàn)樽陨淼纳L(zhǎng)環(huán)境影響對(duì)某些污染物具有一定的適應(yīng)性，如果不能妥善解決，將會(huì)嚴(yán)重影響監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性。而且處于不同生長(zhǎng)階段的草履蟲對(duì)外界的刺激所產(chǎn)生的反應(yīng)也是有所差異的，這些都將會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的平行性和可信度。

目前，草履蟲的培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，而且培養(yǎng)出的草履蟲生長(zhǎng)階段、生長(zhǎng)速度不一致。因此，為了能夠在實(shí)際應(yīng)用中勝任精確的監(jiān)測(cè)工作，培養(yǎng)無(wú)背景處于同一生長(zhǎng)階段的模式生物草履蟲是現(xiàn)在迫切需要解決的問(wèn)題。對(duì)于無(wú)背景草履蟲的培養(yǎng)，可以在最適溫度和pH條件下使用單一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，保證草履蟲在生長(zhǎng)過(guò)程中不受外界污染源的影響。而對(duì)于單一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的選擇，根據(jù)草履蟲的食物攝取情況，可以選擇某一種純培養(yǎng)的細(xì)菌，也可以選用一種或多種氨基酸配制無(wú)菌培養(yǎng)液。

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