導語：如何才能寫好一篇春天的諺語，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

【春天的諺語】

立春

在笑嘻嘻的雪人后面，淘氣地躲著。

在火辣辣的爆竹聲里，開心地笑著。

在紅彤彤的春聯(lián)上蕩啊蕩啊蕩起了秋千。

到處瘋跑的小孩子，忽然累了

厚厚的棉衣里沁出細細的汗

雨水

從雨水聯(lián)想到的，是些多么美麗的漢字啊。

沐浴。清新。溫澤。滋潤。潔凈。

淋了山野，濕了樹林

匯入清溪，滲進土地

滌去春閨輕愁，洗盡游子的風塵

驚蟄

嬉戲的孩子在傾聽

忙碌的大人在傾聽

花兒在傾聽，草也在聽

這第一聲雷

熟睡著的小蟲子一下被驚醒

廣袤的土地上驀然探出

無數(shù)枝 敏感的觸角

春分

白天與黑夜一樣長

詩歌與春天一樣長

春到橋頭薺菜花

紅杏枝頭春意鬧

春*滿園關(guān)也關(guān)不住啊，

紅的是櫻桃 綠的是芭蕉

清明

所有該在春天唱歌的花都開了

所有該在春天跳舞的樹都綠了

所有該在春天記起的人 都在心里一遍遍溫習了

清明 有多綿綿密密的雨

就有多么綿綿密密的憂傷與思念啊

谷雨

是俗諺里最厚重的一頁春天

是田野里最喧鬧的一節(jié)春天

偏以這樣濃艷的語言說再見

篇2

春雨貴如油

春無三日晴

立春趕春氣

早春晚播田

春風如醇酒，著物物不知

春天孩兒面，一日三變臉

立春打雷，十處豬欄九處空

不知細對誰裁出，二月春風似剪刀

一年之計在于春，一日之計在于晨。

南園桃李花落盡，春風寂寞搖空枝

天街小雨潤如酥，草色遙看近卻無

芳樹無人花自落，春山一路鳥空啼

二月風光濃似酒，小樓新濕青紅

侵陵雪色還萱草，漏泄春光有柳條

江浦雷聲喧昨夜，春城而色動微寒

侵陵雪色還萱草，漏泄春光有柳條

有時三點兩點雨，到處十枝五枝花

恰似春風相欺得，夜來吹折數(shù)枝花

篇3

1、春風不刮，草芽不發(fā)。

2、一年四季春為首。

3、立春之日雨淋淋，陰陰濕濕到清明

4、雷打立春節(jié)，驚蟄雨不歇。

5、春天人們起得早，秋后人馬吃得飽。

6、肥不過春雨，苦不過秋霜。

7、春天孩子面，一日三變臉。

8、立春打雷，十處豬欄九處空。

9、季節(jié)不等人，春日勝黃金。

10、立春趕春氣。

11、雨淋春牛頭，七七四十九天愁。

篇4

2、立春晴，雨水均。

3、立春晴一日，耕田不費力。

4、水淋春牛頭，農(nóng)夫百日憂。

5、春天孩子面，一日三變臉。

6、立春打了霜，當春會爛秧。

7、立春天氣晴，百事好收成

8、立春之日雨淋淋，陰陰濕濕到清明。

9、春天人們起得早，秋后人馬吃得飽。

10、肥不過春雨，苦不過秋霜。

11、初一如下雨，初二則會放晴，初三若下雨則會落到十五。難估計。

12、立春趕春氣。

13、雷打立春節(jié)，驚蟄雨不歇。

14、立春天氣晴，百事好收成。

15、立春打雷，十處豬欄九處空。

16、雨澆上元燈，日曬清明日：上元日下雨，清明定放晴。

17、春風不刮，草芽不發(fā)。

篇5

The beginning of spring rain, rainwater

2、立春晴一日，耕田不費力

The beginning of spring sunny day, and effortless

3、立春之日雨淋淋，陰陰濕濕到清明

The beginning of spring, rain, cloudy and wet to the tomb

4、雨淋春牛頭，七七四十九天愁。

The rain spring Ngau Tau, seven seven forty-nine days of sorrow.

5、水淋春牛頭，農(nóng)夫百日憂

The water spring, the hundred days of sorrow

6、立春打了霜，當春會爛秧

The beginning of spring to frost, when the spring seedling rot

7、雷打立春節(jié)，驚蟄雨不歇。

Thunder made the Spring Festival, the rain did not stop the awakening of insects.

8、臘月立春春水早，正月立春春水遲。

Twelfth lunar month of lunar January Chunshui early spring, late spring.

9、年逢雙春雨水多，年逢雙春好種田。

Years to meet the double spring water, years to meet the double spring good farm.

10、雨水連綿是豐年，農(nóng)民不用力耕田

Rain is harvest, farmers do not forcibly plow

11、立春趕春氣：立春之后萬象回春，稻田、池塘等水面開始蒸發(fā)，明示世人春天已降臨。

The beginning of spring to spring: spring after Reviver, paddy fields, ponds and other water evaporates, express the world spring has come.

12、初一落初二散，初三落月半：初一如下雨，初二則會放晴，初三若下雨則會落到十五。難估計。

The first fall two powder, the third fall half: first day such as rain, the second is cleared, the third if rain will fall fifteen. Difficult to estimate.

13、雨澆上元燈，日曬清明日：上元日下雨，清明定放晴

The rain poured lantern lights, sun Tomb Sweeping Day: Shangyuan day rain, Qingming will clear up

14、早春晚播田：立春日如在上年十二月內(nèi)謂之早春，若播種莫過早也不過遲，按季節(jié)行事。

Da: early spring day such as early spring in December last year in that, if not early than late sowing, according to season.

篇6

1、春陰垂野草青青，時有幽花一樹明。晚泊孤舟古祠下，滿川風雨看潮生。宋蘇舜欽《淮中晚泊犢頭》

2、春在亂花深處鳥聲中。宋陳亮《南歌子》

3、道由白云盡，春與青溪長。唐 劉虛《闕題》

4、等閑識得東風面，萬紫千紅總是春。宋朱熹《春日》

5、東風灑雨露，會人天地春。唐 李白《送祁昂滴巴中》

6、東風隨春歸，發(fā)我枝上花。唐 李白《落日憶山中》

7、二月湖水清，家家春鳥鳴。唐 盂浩然《春中喜王九相尋》

8、春日遲遲，卉木萋萋。倉庚喈喈，采蘩祁祁?！对娊?jīng)小雅出車》

9、碧玉妝成一樹高，萬條垂下綠絲線。不知細對誰裁出，二月春風似剪刀。唐 賀知章《詠柳》

10、池塘生春草，園柳變鳴禽。南朝宋 謝靈運《登池上樓》

11、春草如有情，山中尚含綠。唐 李白《金門答蘇秀才》

12、春風如醇酒，著物物不知。宋程致道《過紅梅閣一首》

13、春來——爆竹聲中一歲除，春風送暖入屠蘇。

14、春雨——小樓一夜聽春雨，深巷明朝賣杏花。

15、春花——惆悵東欄一株雪，人生看得幾清明。

16、春夜——更深月夜半人家，北斗闌干南斗斜。

17、春水——春水碧于天，畫船聽雨眠。

18、惱人天氣又春陰。 ——宋·晏殊

19、料峭春風吹酒醒，微冷，山頭斜照卻相迎。 ——宋·蘇軾

20、東風有信無人見，露微意，柳際花邊?！巍ぬK軾

21、乍暖還寒時候，最難將息。 ——宋·李清照

22、洛陽城里又東風，未必桃花得似舊時紅。 ——宋·陳與義

23、東風知我欲山，吹斷檐間積雨聲。

24、春心莫共花爭發(fā)，一寸相思一寸灰。

25、春風——春風又綠江南岸，明月何時照我還。

26、春光——等閑識得東風面，萬紫千紅總是春。

27、春景——試上超然臺上看，半壕春水一城花。

28、春游——東風知我欲山，吹斷檐間積雨聲。

29、春思——春心莫共花爭發(fā)，一寸相思一寸灰。

30、春寂——春潮帶雨晚來急，野渡無人舟自橫。

31、春愁—問君能有幾多愁，恰似一江春水向東流

32、池塘生春草，園柳變鳴禽。 ——南朝宋謝靈運

33、城上風光鶯語亂，城下煙波春拍岸。 ——宋·錢惟演

34、落盡梨花春又了，滿地殘陽，翠色和煙老。 ——宋·梅堯臣

35、雪消門外千山綠，花發(fā)江邊二月晴。 ——宋·歐陽修

36、寒雪梅中盡，春風柳上歸。唐 李白《宮中行樂詞八首》

37、寄語洛城風日道，明年春色倍還人。唐 杜審言《春日京中有懷》

38、林花掃更落，徑草踏還生。唐 孟浩然《春中喜王九相尋》

39、滿眼不堪三月喜，舉頭已覺千山綠。宋辛棄疾《滿江紅》

40、時有落花至，遠隨流水香。唐 劉虛《闕題》

41、時在中春，陽和方起?！妒酚浨厥蓟时炯o》

42、聞道春還未相識，走傍寒梅訪消息。唐 李白《早春寄王漢陽》

43、咸陽二三月，宮柳黃金枝。唐 李白《古風》

44、喧鳥覆春洲，雜英滿芳甸。南朝梁 謝眺《晚登三山還望京邑》

45、燕燕飛來，問春何在，唯有池塘自碧。宋姜夔《淡黃柳》

46、陽春白日風在香。晉 樂府古辭《晉白綺舞歌詩三首》

47、陽春布德澤，萬物生光輝。 漢樂府古辭《長歌行》

48、陽春二三月，草與水同色。晉 樂府古辭《盂珠》

49、云霞出海曙，梅柳渡江春。淑氣催黃鳥，晴光轉(zhuǎn)綠蘋。唐 杜審言《和晉陵陸丞早春游望》

50、——枕上片時中，行盡江南數(shù)千里。

51、春恨——人生自是有情癡，此恨不關(guān)風和月。

52、春歸——落紅不是無情物，化作春泥更護花。

53、春事到清明，十分花柳。喚得笙歌勸君酒。酒如春好，春色年年如舊。宋辛棄疾《感皇恩為范壽》

54、春晚綠野秀，巖高白云屯。南朝宋 謝靈運《入彭蠡湖口》

55、飛雪伴春還，善庭曉自閑。唐 劉虛《積雪為小山》

56、過春風十里，盡薺麥青青。宋姜夔《揚州慢》

57、芳菲消息到，杏梢紅?！巍べR鑄

58、午睡漸多濃似酒，韶華已入東君手。—— 宋·周邦彥

59、枕上片時中，行盡江南數(shù)千里。

60、人生自是有情癡，此恨不關(guān)風和月。

61、春潮帶雨晚來急，野渡無人舟自橫。

62、問君能有幾多愁，恰似一江春水向東流。

篇7

關(guān)于春天的演講稿大全

春天，萬物復蘇，冰雪融化。小河又在奔跑，一邊跑一邊在唱著歡快的歌呢!看，它跑到田野去，讓麥子喝夠了水;流到樹林里去，讓樹兒長得更加茂盛;奔到草地邊，讓小草長得更加綠。小魚在清澈見底的小河里自由自在地玩耍。太陽下，水面波光粼粼，水里的一顆顆鵝卵石，如同一顆顆閃耀著耀眼的光芒的寶石，美麗極了。小河邊的棵棵柳樹，長出了嫩嫩的綠芽。搖一搖小柳樹，飄下了紛紛揚揚的“雪花”，如同又回到了銀色的冬天。風兒吹過，一條條柳枝如同春姑娘那細細的頭發(fā)，在風中跳起了優(yōu)美的舞蹈，舞姿婀娜多姿，美極了!那棵棵柳樹倒映在水中，好像那樹是從水中長出來的。

春天，田野里，農(nóng)民伯伯播種下新的希望，希望今年有好的收獲。

草地上，一只只風箏上的老鷹，不知被誰施了魔法，竟然飛上了天，翱翔在寬闊的天空里。一只只風箏飛上了天，有的飛得很高，有的飛不起來。

下面，人們坐在綠油油的草地上，有的在講笑話;有的在打撲克;有的在踢足球……

春天，花園里的鮮花百花齊放，有紅的、黃的、藍的、白的……數(shù)也數(shù)不清，真是五顏六色。鮮花的顏色招來了許多蜜蜂、蝴蝶，讓小花變得更加美麗。

如果人人都不亂扔垃圾，那我們春天的花園將變得更加美麗，更加美好。

美麗的春天，I Love you!

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各位老師各位同學：

大家好!在這明媚的春光里，衷心祝愿大家都能播種下新的希望、新的夢想!是的，春天是個播種的季節(jié)，是個希望的季節(jié)，是個醉人的季節(jié)!當春帶著她特有的新綠，海一樣地漫來時，真能讓人心醉;

當春攜著她特有的溫煦，潮一樣地涌來時，也能讓人斷魂。

春，絕對是一楨浸染著生命之色的畫布。

新綠、嫩綠、鮮綠、翠綠，滿眼的綠色呀，溫柔著我們的視線。還有那星星般閃動的一點點紅、一點點黃、一點點粉、一點點紫呀，也驚喜著我們的目光。

于是，開始在春天漫步。

踩在她松軟的泥土上，才知道生命的溫床可以如此地平實。只要季節(jié)的老人飄然而至，所有沉睡的種子，都可以在這里孕育，并賦予生命一種變換的姿態(tài)。

春，絕對是一幅飽蘸著生命繁華的畫卷。

無論是破土而出的，還是含苞待放的;無論是慢慢舒展的，還是緩緩流淌的;也無論是悄無聲息的，還是鶯鶯絮語的，只要季節(jié)老人把春的帷幕拉開，他們就會用自己獨特的方式，在這里匯演自然那神奇的活力。

于是，開始在春天漫游。

披著柔媚的春光，讓略帶甜意的風，從身邊掠過。就會領(lǐng)悟到春的氣息里，其實包含著一種最令人感動的柔情。也會覺得大自然就是一位奇特的母親，她竟選擇在萬物蕭條的冬的盡頭，將千姿百態(tài)的生命孕育而出，讓它們踏著那最為柔媚的第一縷春光，相擁而至，把無限的生機帶給人世。

春，也是一拱彰顯著生命神奇的畫廊。

你看，每一種生命都有自己特定的形態(tài)，而每一種特定的形態(tài)，都包含著特定的生命信息。無論是高大的，還是弱小的，都要經(jīng)歷著有生也有死的歷程，也都有稚氣和成熟的時節(jié)。無論是引人注目的，還是平淡無奇的，都要沿著那特定的時令軌跡，在自己特定的生存空間里，完成一段生命的壯舉。也無論是否有名有分，無論是生在富饒的家園，還是長在貧瘠的沙土，所有所有的、所有的在春天萌生的萬物呀，都用自己獨特的方式，用盡全部的熱情，譜出一曲生命的頌歌。

這就是春，因著萌生在這里的生命的齊奏，讓我真真切切感受到一種神奇的美麗。

謝謝大家!

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春天在哪里呀?春天在哪里?春天在那翠綠的山林里……”我們唱著歌兒去外面找春天。

到了蟒河邊，哇，河邊垂柳的枝條更長了、更綠了，真是“碧玉妝成一樹高，萬條垂下綠絲絳。”呀!風一吹，綠綠的枝條飄過來又飄過去，像春姑娘的頭發(fā)在寫字，告訴我們：春天已經(jīng)來到了!

河邊的小草發(fā)芽了，還有許多五顏六色的花兒：有紅的、有白的、有黃的、有粉的、還有一

些藍的，美麗的蝴蝶在花叢中飛來飛去!媽媽告訴我：黃的是迎春花和油菜花、粉的是桃花、紅的是海棠花、白的是梨花，不知道名字的藍色的小花兒在草地上像星星一樣，好漂亮啊!

你們看!春風吹到河面上，河面好像有許多皺紋!幾只小鴨子在鴨媽媽的帶領(lǐng)下，“嘎嘎”地唱著歌，在河里游來游去，真開心呀!

春天多美啊!

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一腳踏進公園的北門，就被里面迎面撲來的花香所陶醉，跟隨著小鳥嘰嘰喳喳的叫聲，不知不覺地來到了一片綠色的世界里，眼睛已經(jīng)被綠色蒙住了雙眼，都睜不開啦，我深深吸了口氣，啊!好清新!來到小鳥旁邊，發(fā)現(xiàn)好多老爺爺坐在鳥籠旁邊，多像一幅美麗的畫卷。

院里的花大都競相開放，紅的，粉的，白的，只有花中之王牡丹靜待開放，我會靜靜地等你開放，下次在來看你的，牡丹!前來散步的阿姨都被這一片春光吸引的贊不絕口，還回想著去年牡丹開放的景象，我也不知不覺地想起去年去洛陽看牡丹了，今年就不用千里迢迢地跑到洛陽了，因為戚城公園滿園的春*已經(jīng)把我深深地陶醉了!平日生活在人潮洶涌的都市，沒想到這里還有一個世外桃源!

平時懶得活動的我今天看見這綠色我也好好養(yǎng)養(yǎng)眼，不一會兒就逛完了一大圈，雖然有點累，但是心里很是愉快!俏皮的春姑娘總是把自己打扮的花枝招展，在人們面前炫耀著!

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春姑娘那沙沙的腳步聲近了!那無際明媚的春*把大自然裝扮的更加嬌嬈。

你看，小草不知什么時候偷偷的從土里鉆出來，挺胸抬頭探望著這一片稀奇的世界。它在春風的吹拂下輕盈舞動，似擺動的綠絨毯。

河邊的柳枝也悄悄的伸進解冰的小河里，好似在跟小河親切的言好、在和小河議論春*。微風吹來，映在水里的青山綠樹，一會兒擴大，一會兒縮小，一會兒聚攏，一會兒散開，美麗極了。

春天的陽光更是暖洋洋得照在人們的臉上，使人陶醉。春天的陽光像一個溫熱的火爐，散發(fā)著春的光芒;照在綠色的大地上，金光粼粼。

春天的白云也格外多姿，像奔騰的小馬，像翻滾的浪花，又像春姑娘白凈的臉，使人們感到精神舒爽，感到心曠神怡。

篇8

教材：

活動目標：

1.理解詩歌的內(nèi)容，引導幼兒感受詩歌的美好意境，初步了解詩歌的結(jié)構(gòu)特點。

3.有感情的朗誦散文詩，感受春天的美好。

一、經(jīng)驗準備

二、物質(zhì)準備

（二）鋼琴協(xié)奏曲《春》。

三、說教學法

（二）練習法：朗誦環(huán)節(jié)所設計的采用多種形式進行朗誦練習，能夠使幼兒體驗朗誦的樂趣、感受詩歌的意境，還突出了本次活動的重點。

活動過程：

引導幼兒運用已有經(jīng)驗描述春天的美麗景色。

（環(huán)節(jié)簡析：教師將幼兒的描述用散文詩的句式進行提煉，使幼兒自然產(chǎn)生一種成就感，提高幼兒的學習興趣，對詩歌有一個最初的感受，更為順利過渡到下一環(huán)節(jié)做了鋪墊 。）

（一）欣賞

教師：小朋友，老師看到的春天像一本書。我們來聽一聽春天是一本什么樣的書？教師播放輕柔舒緩的音樂，有感情的朗誦詩歌。

教師：小朋友，這一遍我們仔細聽一聽彩色的書里有什么？會笑的書里有什么？會唱歌的書里有什么？

（二）分段理解詩歌內(nèi)容，把握詩歌中的重難點部分

教師：請小朋友說一說，詩歌里為什么說春天是一本彩色的書呢？我會引導幼兒通過觀察圖片，來發(fā)現(xiàn)春天的色彩，從而理解此句詩文的含義。

教師：春天還是一本會笑的書呢。小池塘笑的時候出現(xiàn)了酒窩，它的酒窩是怎么來的呢？（這是一個重點的部分，小朋友可能會回答不出來，這時我會引導幼兒運用已有的生活經(jīng)驗，回憶出風吹池塘水時出現(xiàn)的漣漪、石子投進水里時出現(xiàn)的漣漪等現(xiàn)象，幫助幼兒理解“小池塘的酒窩”是怎樣形成的。）

教師：在最后一本會唱歌的書里，是誰在唱？它們是怎樣唱的？（這部分的學習理解主要突出四個象聲詞的引領(lǐng)，從而使幼兒理解詩文的含義。）

（三）朗誦

教師：請小朋友看著小圖書自己朗讀，先說詩歌的名字再朗誦詩歌。

（環(huán)節(jié)簡析：本環(huán)節(jié)采用了兩個有效策略，一是邊看小圖邊朗讀，二是采用多種形式練習朗讀。不同的朗誦形式激發(fā)幼兒朗誦的熱情，避免了乏味練習。）

（一）討論

教師：春天還會是一本什么樣的書？

（二）創(chuàng)編

教師：老師相 信，小朋友們能夠自己說出春天是一本什么樣的書、書里都有什么。

附：

春天是一本彩色的書，

紅的桃花，

白的梨花；

小池塘笑了，

小朋友笑了，

春天是一本會唱歌的書，

春雨滴滴答，

青蛙呱呱呱。

本次活動，通過活動前帶幼兒到戶外觀察感知春天的主要特征，活動中聽、說、看、仿編等多種途徑，使幼兒很好地理解詩歌，充分體會、感受詩歌的意境，激發(fā)幼兒對散文詩的喜愛，提高幼兒的朗誦、仿編等文學素養(yǎng)。同時，還能積累更多有關(guān)春天的生活經(jīng)驗和知識經(jīng)驗。

當幼兒對散文詩的學習、理解和體驗達到一定程度時，教師進一步創(chuàng)設機會，提出發(fā)散性問題，讓幼兒擴展自己的想象，創(chuàng)造性地運用語言去表達自己的認識和想法，對作品進行仿編。幼兒在仿編中通過對原作品結(jié)構(gòu)的模仿、語言的運用、意韻的揣摩，能夠達到一種創(chuàng)造性、深層次的學習。

研討小組意見：

篇9

老師們，同學們：

早上好！今天我國旗下講話的題目是：與春天相約 與文明同行。

現(xiàn)在，又到了桃紅柳綠，春暖花開的季節(jié)。當你走出戶外，看到路邊的花兒在一場春雨過后悄然綻放；當你放眼望去，路上行人的衣衫一天比一天薄了；抬頭看，天空中不時飛過一只又一只小鳥……是啊，春風拂面，令人不由得心中涌動起這樣一種渴望：讓我們踏青去吧。

春天，繁華似錦；春天，水綠山青；春天，洋溢著詩情畫意。畫家描繪她，詩人歌唱她。踏著詩人的足跡，我們將要走向自然，去看“黃四娘家花滿蹊，千朵萬朵壓枝低”，去看“留連戲蝶”，去看“自在嬌鶯”。去感受那“滿園春*關(guān)不住，一枝紅杏出墻來”的盎然生機。去清新的大自然，綠湖泛舟；去樸實的農(nóng)人家，感受獨特的民俗文化；去可愛的小動物身邊，歡樂嬉戲；去盡情地游戲，在游戲中培養(yǎng)合作意識，培養(yǎng)團隊精神，接受鍛煉，體驗成功的喜悅……

讓我們?nèi)ンw驗春天，接受大自然給予我們的禮物吧！

親愛的同學們，我們該還春天什么禮物呢？

我衷心地希望同學們在親近綠色、感受春天的實踐活動中，在享受快樂，凈化心靈的同時，也撒播文明的種子。撿起一片垃圾，還春天一份整潔；種下一棵小苗，還春天一份希望；呵護一只小鳥，還春天一份生機；揚起一張笑臉，還春天一份溫柔……以我們的實際行動為人與自然的和諧做貢獻。請大家記?。鹤匀皇敲利惖?，我們是文明的；與春天相約，與文明同行。

篇10

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；巴戟天；牛膝；醇提物；軟骨細胞；增殖；大鼠

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種臨床常見的骨科退行性疾病，由于生物力學作用異常等疊加因素的影響，引起關(guān)節(jié)軟骨代謝及修復功能失衡，進而加劇關(guān)節(jié)軟骨退變，造成關(guān)節(jié)損害。臨床表現(xiàn)常以關(guān)節(jié)反復性疼痛、腫脹、活動障礙為主。鑒于其發(fā)病周期長、致殘率高等特點，對其防治具有重要現(xiàn)實意義[1-2]。目前，治療OA的方法眾多，大致可分保守治療和手術(shù)治療兩大類。其中，保守治療以藥物為主，西醫(yī)主要有口服和局部給藥兩種方式，前者因非甾體抗炎藥等產(chǎn)生的胃腸道不良反應而使用受限，而后者可有感染危險且效果也非常有限；手術(shù)方法作為一種補救措施，因其并發(fā)癥較多，影響因素復雜，且術(shù)后需要長時間康復，遠期療效有待進一步考證。中醫(yī)藥療法治療具有多靶點、療效顯著、副作用小、適合長期治療等優(yōu)勢[3]。

當前，在中醫(yī)藥領(lǐng)域，補肝腎祛風濕法在防治OA上應用廣泛，并成為該領(lǐng)域研究熱點[4]。巴戟天、牛膝均具有補肝腎、祛風濕、強筋骨功效，是臨床治療OA常用配伍藥。巴戟天、牛膝的聯(lián)用可追溯到《備急千金要方》記載的巴戟天酒，其合用可增強補腎強筋、祛風除痹之效用，治療肝腎虧虛型骨痹具有良性作用；另外源自《太平圣惠方》的巴戟丸亦由巴戟天和牛膝組方。因此，本研究旨在觀察藥對巴戟天-牛膝醇提物（M-AAE）對體外培養(yǎng)大鼠軟骨細胞周期蛋白與基因的影響，進而為其闡明防治OA的治療機制及臨床運用提供實驗支持。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠16只，體質(zhì)量90～100 g，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK2012-0001（閩）。

1.2 實驗藥物 中藥材巴戟天和牛膝，均由福州回春中藥飲片有限公司提供。

1.3 主要試劑 磷酸鹽緩沖液（HyClone）；DMEM/LOW GLUCOSE（HyClone）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker Ⅱ（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；RT-PCR引物合成、CyclinD1、CDK4、β-actin引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；TRIZOL（美國life）；異丙醇（國藥集團藥業(yè)股份有限公司）；無水乙醇（國藥集團藥業(yè)股份有限公司）；瓊脂糖（Biowest Agarose）；核酸染料（Solarbio）；WB玻板（美國BIO-RAD）；PMSF（蛋白酶抑制劑）；RISF（裂解液）、蛋白上樣緩沖液、1-StepTM Transfer Buffer、ECL高效顯影液（Thermo）；質(zhì)量分數(shù)為30%的聚丙烯酰胺、Tris（pH = 8.8與pH = 6.8）、SDS（十二烷基磺酸鈉）、10×電泳液、AP（過硫酸銨）、TEMED、50×TAE（碧云天生物技術(shù)研究所）；10×TBST（Solarbio）；高效封閉液（北京康為世紀生物科技有限公司）；一抗（兔抗）、CyclinD1 Antibody、Cdk4 Antibody（C-22，美國Santa Cruz Biotechnology）；二抗（羊抗兔，美國CST）等。

1.4 主要儀器 DNA擴增儀（9600型，美國PE）；低溫高速離心機（64R型，美國BECKMAN）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；超純水裝置（MILLI-Q型，美國MILIPORE）；熒光倒置相差顯微鏡（Olympus，日本TKO）；無菌操作臺（AIRTECH型）、超凈工作臺（SW-CJ-1F型）（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（GELDOC2000型，美國BIO-RAD）；全自動酶標儀（BIO-TEK ELX800型，美國BIO-Tek）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（BB16/BB5060型，德國Heraus）等。

2 方 法

2.1 M-AAE的提取 稱取巴戟天、牛膝各100 g，依次經(jīng)粉碎、篩檢后移入裝有500 mL質(zhì)量分數(shù)為50%乙醇的燒瓶中浸漬7 d，收集上清液；再加入500 mL質(zhì)量分數(shù)為50%乙醇，依法浸漬7 d，再次收集上清液；第3次加入500 mL質(zhì)量分數(shù)為50%乙醇，繼續(xù)浸漬7 d后收集上清液，最后合并3次浸出液，靜置24 h，過濾，濃縮，回旋蒸發(fā)乙醇，97 ℃水浴鍋持續(xù)蒸干水分，即得M-AEE提物浸膏。后置于烘干箱^續(xù)蒸干，待低溫下研磨成粉末狀。實驗用時進行精確稱量，并使用DMEM在低頻超聲下溶解，再經(jīng)0.22 μL無菌濾嘴濾過后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 軟骨細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 在麻醉狀態(tài)下進行脫頸椎處死SD大鼠，每次3只，分離膝關(guān)節(jié)處關(guān)節(jié)軟骨。收集并剪碎至1 mm3/單位體積，PBS緩沖液沖洗至少3次后移至無菌小培養(yǎng)皿中，按每個器皿2.5 mL的體積加入質(zhì)量分數(shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶進行消化，15 mL離心管收集消化后的上清液（每次2 h），1500 r?min-1離心機離心后棄上清液，移液器代液（含質(zhì)量分數(shù)為10%胎牛血清DMEM）狀態(tài)緩慢吹勻沉淀。經(jīng)計數(shù)板計數(shù)（2×105?mL-1）后種植原代軟骨細胞于培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，48 h后初次換液。鏡下觀察細胞鋪滿80%瓶底面積時，經(jīng)胰酶消化進行細胞傳代。本實驗使用第2代軟骨細胞[5]。

Ⅱ型膠原免疫組織化學染色：軟骨細胞（經(jīng)計數(shù)每毫升2500個）待爬片后，經(jīng)PBS沖洗3次，質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定30 min。再經(jīng)沖洗、裂解（質(zhì)量分數(shù)為0.1%的破膜劑50 μL）20 min，沖洗后加入50 μL質(zhì)量分數(shù)為3%的H2O2反應

20 min。再次沖洗后經(jīng)5% BSA封閉30 min，設置陽性對照組、陰性對照組。陽性對照組加入含Ⅱ型膠原1∶200的一抗反應過夜，陰性對照組加入PBS作為對照。后經(jīng)PBS沖洗3遍后加入50 μL二抗（1∶200）反應30 min，再次沖洗后以每張玻片50 μL DAB進行浸潤10 min。再依次經(jīng)過漂洗、蘇木素復染、沖洗（PBS）、返藍2 s、常溫晾干、梯度酒精、二甲苯進行脫水與透明后封片觀察[6]。

2.3 MTT測定M-AAE干預后軟骨細胞增殖活性

以96孔板為載體培育經(jīng)計數(shù)為每孔2×103的第

2代軟骨細胞24 h后，再饑餓細胞同步培養(yǎng)24 h，

棄去舊液更換含質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)，標記分組后依次加入0，75，150，300，600 μg?mL-1濃度的M-AEE分別培養(yǎng)24，48，72 h。后續(xù)操作依次為：棄凈每孔舊液、

37 ?C溫箱MTT（每孔100 μL）反應5 h、二甲基亞砜（DMSO）振蕩條件下反應10 min（每孔100 μL）、

酶標儀570 nm波長下檢測每孔OD值、記錄與分析。

2.4 M-AEE干預軟骨細胞活性鏡下觀察 軟骨細胞的分離和培養(yǎng)，選取實驗所需細胞，經(jīng)0，75，150，300 μg?mL-1濃度的總醇提物DMEM溶液干預48 h后，使用光鏡觀察。

2.5 RT-PCR法檢測CDK4、Cyclin D1 mRNA表達

2.5.1 CDK4、Cyclin D1 mRNA引物設計與合成見表1。

2.5.2 RT-PCR方法 使用核酸蛋白檢測儀檢測所提Total RNA濃度，當A260/A280比值在1.8～

2.0時，表明本實驗所提取的軟骨細胞Total RNA純度較高。然后進行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應，制備質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠。成膠后取出浸入電泳槽，加TAE（1×）電泳緩沖液，排除氣泡。取上述各組RNA 每孔5 μL、Marker 每孔4.5 μL，電泳條件為100 V、70 mA、15 min，使用BIO-RAD Fluor-S TM Multi Imager圖象分析儀下掃描，經(jīng)分析后拍照存檔。

2.6 Western Blot檢測CDK4、Cyclin D1蛋白含量 設置分組（0，75，150，300 μg?mL-1組），經(jīng)M-AAE干預48 h后，依次經(jīng)PBS沖洗后吸凈、加入裂解液（含100∶1蛋白酶抑制劑PMSF）、收集經(jīng)刮刀刮取的細胞后離心取上清進行蛋白提取，參照碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明進行定量；制備質(zhì)量分數(shù)為12%分離膠與質(zhì)量分數(shù)為5%濃縮膠進行灌板，按每孔50 μg量算上樣體積后依次加入，蛋白Marker加入每孔5 μL，在恒流下以20 V電壓先跑10 min，再調(diào)整到100 V電壓跑至分離膠底部進行電泳；調(diào)整電流為1.3 A、電壓25 V，本實驗中以β-actin耗時為7 min、CDK4為5 min、Cyclin D1為5 min進行半干式轉(zhuǎn)膜，再經(jīng)TBST中漂洗、封閉、洗膜、一抗過夜（1∶1000濃度的β-actin、CDK4、Cyclin D1）、TBST漂洗、二抗（1∶5000）封閉后洗膜進行顯影。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，采用t檢驗和單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細胞觀察與鑒定 第2代軟骨細胞鏡下觀察：分布均勻，邊界清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，呈明顯的鋪路石狀外觀；經(jīng)Ⅱ型膠原免疫組化染色后，陽性對照組胞漿區(qū)為棕黃色，陰性對照組胞漿區(qū)顏色透明。以上可鑒定本實驗所用細胞為軟骨細胞。見圖1。

3.2 M-AEE對軟骨細胞增殖的時效與量效關(guān)系 用MTT法檢測M-AAE在不同濃度（0，75，150，300，600 μg?mL-1）及不同時間（24，48，72 h）對軟骨細胞增殖特性的影響。與0 μg?mL-1組比較，24，48，72 h的OD值均有升高，其中以48 h與150 μg?mL-1條件下軟骨細胞增殖明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。進而推測M-AAE干預軟骨細胞后，對其增殖具有一定的時效-量效關(guān)系。其最佳干預時間和濃度分別為48 h和

150 μg?mL-1。見表2。

3.3 M-AEE干預軟骨細胞活性鏡下觀察 經(jīng)0，75，150，300 μg?mL-1濃度的總醇提物DMEM溶液干預48 h后，行光鏡下觀察：0 μg?mL-1濃度下觀察細胞外觀形似扁平狀，胞漿豐富，胞核清晰，具有1～2個核仁，細胞數(shù)目較少，見圖2（1）；經(jīng)75 μg?mL-1濃度干預后，細胞分布均勻，大部為扁平狀、細胞狀態(tài)較好且細胞數(shù)量較多，見圖2（2）；經(jīng)150 μg?mL-1濃度干預后，軟骨細胞緊貼聚集生長，外觀以扁平狀為主，邊界清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，細胞核清晰、飽滿，細胞狀態(tài)佳，細胞數(shù)目最多，見圖2（3）；經(jīng)300 μg?mL-1濃度干預后，細胞數(shù)目較多但細胞核不規(guī)則，培養(yǎng)基中漂浮細胞較多，細胞狀態(tài)欠佳，見圖2（4）。

3.4 RT-PCR檢測結(jié)果 M-AAE干預軟骨細胞后，各加藥組CDK4、ClinD1的mRNA的表達量均明顯高于0 μg?mL-1組，其中以150 μg?mL-1組的表達量最高（P < 0.01）。75 μg?mL-1組和300 μg?mL-1

組在CDK4及Cyclin D1 mRNA上比較，其表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖3。

3.5 Western blot檢測結(jié)果 M-AAE干預軟骨細胞后，各加藥組CDK4、ClinD1蛋白表達量明顯高于0 μg?mL-1組，其中以150 μg?mL-1組的表達量最高（P < 0.01）。75 μg?mL-1組和300 μg?mL-1

組相比，在Cyclin D1和CDK4指標上，其蛋白含量的表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖4。

4 討 論

OA屬中醫(yī)學“骨痹”范疇，其病機主要在于“天癸竭，形體衰”導致肝腎虧虛，進而加劇筋骨失養(yǎng)，最終表現(xiàn)為關(guān)節(jié)不利、疼痛纏綿?；凇澳I主骨、肝主筋”“肝腎同源”理論，腎精充足則肝血充盈，肝血得到濡養(yǎng)則能化精，腎精方可充滿，由此可見，腎中精氣的氣化與肝血的化生存在互生互利的密切聯(lián)系。鑒于OA的病位在“肝腎”而外現(xiàn)于“筋骨”，故通過補肝腎、祛風濕法使經(jīng)絡通達，則肝腎精華得以濡養(yǎng)筋骨，從而驅(qū)逐滯留關(guān)節(jié)外邪，以達通利關(guān)節(jié)之效[7]。巴戟天、牛膝則以其補肝腎、祛風濕的作用整體切合OA的病機?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天主要化學成分有糖類、蒽醌類、環(huán)烯醚萜苷類、有機酸類、微量元素、氨基酸和甾醇類等，具有改善機體免疫功能、抗氧化、強壯骨骼、抗炎鎮(zhèn)痛補血及促進造血干細胞增殖和分化等作用[8-10]。牛膝作為臨床治療OA常用藥物，可引經(jīng)下行，治療OA發(fā)揮重要作用，研究表明，其主要成分有皂苷、脫皮甾酮、牛膝甾酮及糖類物質(zhì)，并具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凝血等作用[11-13]。

鑒于細胞活力與細胞數(shù)呈正相關(guān)性，本實驗首先運用MTT比色法檢測狗脊多糖在不同濃度下對體外培養(yǎng)SD大鼠軟骨細胞活性作用的影響，結(jié)果顯示，M-AAE對軟骨細胞增殖的影響與其藥物濃度和時間有關(guān)，其最佳時效-量效關(guān)系為48 h和150 μg?mL-1；軟骨細胞可發(fā)生有絲分裂，產(chǎn)生子代軟骨細胞，以此維持關(guān)節(jié)功能趨于穩(wěn)定。鑒于細胞有絲分裂的表現(xiàn)形式類似圓周循環(huán)，即具有周期性，通常稱之為細胞周期，而對其調(diào)控發(fā)揮主要作用的內(nèi)源性途徑主要由細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）等組成，兩者的協(xié)同作用可直接推動骨細胞跨越位于DNA合成起始部的G1/S

周期，進而決定細胞分裂，從而影響細胞增殖結(jié)果[14-15]。故本研究基于G1/S周期的CDK4、Cyclin D1的正性調(diào)節(jié)作用，初步探討M-AAE對體外培養(yǎng)大鼠軟骨細胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 μg?mL-1組相比，M-AAE在一定條件下可上調(diào)CDK4、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。進而提示M-AAE可通過促進軟骨細胞G1/S期的轉(zhuǎn)變，加速細胞分裂，對軟骨細胞增殖具有正性調(diào)控作用，從而為其在臨床應用于OA提供相關(guān)依據(jù)。

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