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篇1

自2000年開始，由日本里原宿街頭文化所延伸出的潮流風(fēng)潮席卷全球，而復(fù)古元素作為這其中最具分量的組成部分，自然也吸引了無數(shù)年輕人對此趨之若騖。一時間，那些之前甚至快被人們遺忘了的復(fù)古Sneaker紛紛披上全新的外衣再一次閃亮登場。而Air Force 1則無疑是這些球鞋中最具吸引力的。

來自日本的著名Sneaker文化推手，著名Sneaker店鋪Atmos的主理人Hommyo在回憶復(fù)古風(fēng)潮最初開始風(fēng)靡的那段時間時，也曾清楚的記得眾人對于Air Force 1的喜愛――大概是在2000年左右，里原宿包括全日本越來越多的年輕人開始脫下Air Max的跑鞋，到處找尋上世紀(jì)七八十年代的鞋款，一些售賣二手服飾的古著店也因此而開始火爆。我當(dāng)時有一個預(yù)感，Air Force 1和Dunk等球鞋肯定會是大家的終極目標(biāo)，因而我開始聯(lián)系在美國的伙伴，托他們在美國尋找，我甚至親自去了美國無數(shù)次，開著車到美國的多個城市找尋。在一些小的城市里，還看到他們有很多那時庫存的球鞋。于是不管有多少，我們都買下來再帶回日本，但每一次都是供不應(yīng)求，以至于我不得不在日本和美國之間往返。再后來，美國的復(fù)古風(fēng)也開始了，但其實美國的Hip-Hop潮流里Air Force 1一直都有著很高的地位。所以找尋這些球鞋變得越來越難，所以我們開始聯(lián)系Nike的日本分公司，要求他們復(fù)刻這些過去，的球鞋?！?/p>

不過復(fù)古風(fēng)潮其實僅僅是Air Force 1再一次流行的原因之一。正如Hommyo所說的那樣，在美國的街頭潮流中，Air Force 1一直都有著無可取代的地位，這不僅和之前我們所介紹的那些球星以及街頭籃球選手有關(guān)，更與那些來自美國黑人區(qū)的年輕人密不可分。而這些年輕人中，除了其中的一些在籃球領(lǐng)域擁有者巨大的成就，更有人在音樂和其他流行藝術(shù)領(lǐng)域，有著非比尋常的過人之處。這其中就包括了JAY-Z、Kanye West等如今叱咤全球音樂界的天王級人物。而在這些代表者的身后，不僅有著那些追隨他們的鐵桿Fans，還有著不計其數(shù)來自街頭的孩子，他們從小就深受Hip―Hop文化的影響，Air Force 1一直就是他們生活的一部分。如今號稱“Air Force 1之王”的DJ克拉克肯特就是其中的代表

從9歲就開始熱愛Sneaker文化的他，從小就開始靠給鄰居家打零工賺取買球鞋所需的資金，從Pro-Kids到PUMA等等球鞋伴隨著他的孩童時光，而直到1982年Air Force 1的出現(xiàn)，自此他再也沒有穿過別的球鞋。而這位如今已經(jīng)擁有數(shù)千雙Air Force 1的收藏家，在成名之后經(jīng)常拿出自己的球鞋用作慈善，捐獻給其他來自黑人社區(qū)的孩子。類似的例子不計其數(shù)，在這種潛移默化的影響熏陶下，Air Force 1所承載的，儼然已不僅僅是一雙球鞋那么簡單――一種來自美國黑人街頭文化最獨一無二的精神與氣質(zhì)，透過21世紀(jì)以來最炙手可熱的Hip―Hop音樂傳播到地球的每一個角落。人們爭相模仿這些明星和潮流ICON們的裝扮，而Air Force 1則是搭配中最重要的部分。與此同時，Nike自身也開始發(fā)掘這些球鞋和流行文化之間的微妙聯(lián)系，進入21世紀(jì)以來，一雙又一雙的限量別注款A(yù)ir Force 1開始出現(xiàn)，稀少的數(shù)量加上有別于普通版本的配色或細(xì)節(jié)，開始成為熱愛潮流的人們僅僅樂道的話題。在這些人之中就包括，如今在亞洲潮流界呼風(fēng)喚雨的“里原宿潮流教父”藤原浩、香港明星陳冠希等等，而通過這些潮流精英們的影響力，Air Force 1開始受到越來越多普通人的喜愛。這也成就了Air Force 1令其他復(fù)古鞋款所望塵莫及的巨大影響力。

篇2

【關(guān)鍵詞】 儲層 層序地層學(xué) 沉積微相 沉積模式 剩余油

薩北開發(fā)區(qū)Ⅰ類儲層河道發(fā)育規(guī)模大、平面及垂向切疊嚴(yán)重、砂體內(nèi)部構(gòu)型復(fù)雜，Ⅱ類儲層微相類型多樣、相變復(fù)雜，Ⅲ類儲層的成因需進一步明確。針對研究區(qū)儲層特征，應(yīng)用“儲層層次分析和模式預(yù)測”[1，2]砂體解剖方法對各類儲層進行研究，實現(xiàn)成因單砂體時間單元精細(xì)對比；完成了Ⅰ、Ⅱ類儲層單砂體識別，Ⅲ類儲層沉積微相厘定，提高了各類儲層預(yù)測精度，并在此基礎(chǔ)上，按河道砂體形成過程和離湖岸線的遠(yuǎn)近建立Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類儲層沉積模式。

1 區(qū)域概況

薩北開發(fā)區(qū)位于松遼盆地大慶長垣薩爾圖構(gòu)造北部，儲層屬河流～三角洲沉積體系，主要分青一段～姚一段沉積時期的湖退進積三角洲沉積、姚一段～嫩一、二段沉積時期的湖進退積三角洲兩個沉積階段。發(fā)育薩爾圖、葡萄花、高臺子三套油層，可進一步細(xì)分為8個油層組，35個砂巖組，118個沉積單元。

2 沉積模式分析

2.1 剖面精細(xì)對比方法

經(jīng)過研究區(qū)1546口井系統(tǒng)對比分析，按照“旋回對比、分級控制、不同相帶區(qū)別對待”[3]的原則，提出了“封閉骨架剖面控制對比、標(biāo)準(zhǔn)層控制大套地層對比、標(biāo)志層組合對比、特征巖性組合對比、標(biāo)準(zhǔn)層逼近控制對比、沉積模式指導(dǎo)對比”的儲層綜合對比方法，解決了各類儲層復(fù)雜的油層對比問題。

2.2 平面沉積微相類型

研究區(qū)河流相可劃分為點壩、心灘，廢棄河道、天然堤、溢岸薄層砂、河道間泥、決口水道、決口扇8種微相[4]；三角洲相可劃分為分流平原、三角洲前緣2種亞相。三角洲分流平原又可進一部劃分出分流河道、廢棄河道、天然堤、溢岸薄層砂、河道間泥、決口水道、決口扇7種微相；三角洲前緣亞相可劃分出水下分流河道、水下漫流薄層砂、水下分流間灣微相、河口壩4種微相。

2.3 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類儲層沉積模式

2.3.1 Ⅰ類儲層沉積模式

（1）泛濫平原相的辮狀河砂體沉積模式：主要發(fā)育于PI3沉積單元，該時期河流能量強，物源供給充足，以垂向加積為主。主要微相為心灘和辮狀水道。心灘以縱向壩、斜列壩為主，壩長一般250-400m，寬150-250m；辮狀水道寬度在400m-600m，厚度4-7m。

（2）泛濫平原相的曲流河砂體沉積模式：主要發(fā)育于PI2沉積單元，該時期河流側(cè)向遷移頻繁，多期單一河道側(cè)向切疊。廢棄河道發(fā)育，但保存不完整，多呈新月狀、半圓狀。單一河道砂體寬度一般大于500m，砂體總厚度4-7m。

2.3.2 Ⅱ類儲層沉積模式

Ⅱ類儲層屬三角洲分流平原亞相，按其離湖岸線的遠(yuǎn)近分為遠(yuǎn)、中、近岸水上分流河道砂體沉積3種沉積模式（圖1）。

（1）遠(yuǎn)岸水上分流河道沉砂體沉積模式：河道的側(cè)向切疊能力相對曲流河變?nèi)?，單一河道繼承性近南北向展布[5]。廢棄河道、點壩發(fā)育，且廢棄河道保存完整。單一河道砂體寬度一般大于300m，垂向上砂體厚度為2～6m。

（2）中岸水上分流河道砂體沉積模式：仍以河流作用為主控因素，河流的側(cè)向遷移能力進一步變?nèi)?，廢棄河道相對不發(fā)育，河道兩側(cè)伴生溢岸薄層砂。單一河道砂體寬度在300～600m，垂向上砂體厚度2～4m。

（3）近岸水上分流河道砂體沉積模式：由于湖岸線來回擺動，河流和湖泊沉積作用兼具，但以水上河道為主控因素。廢棄河道基本不發(fā)育，河道規(guī)模較小，以道間泥規(guī)模較大為特點。中-小型河道砂體寬度為150～300m，垂向上砂體厚度為2～4m。

2.3.3 Ⅲ類儲層沉積模式

Ⅲ類儲屬于三角洲前緣亞相沉積，按其離湖岸線的遠(yuǎn)近也可細(xì)分為近、中、遠(yuǎn)岸水下分流河道砂體及三角洲外前緣席狀砂沉積4種沉積模式（圖2）。

（1）近岸水下分流河道砂體沉積模式：仍以河道為主控因素，多發(fā)育呈枝狀、窄條狀小型水下分流河道，河道兩側(cè)發(fā)育大面積泥粉和泥質(zhì)。河道砂體寬度小于150m，厚度為1.5～3m。

（2）中岸水下分流河道砂體沉積模式：處于淺湖-半深湖沉積環(huán)境，湖浪改造能力進一步增強，以窄小型水下分流河道及席狀砂為主要沉積類型，分流間泥不發(fā)育。河道砂體寬度小于100m，厚度為1～2m。

（3）遠(yuǎn)岸水下分流河道沉砂體沉積模式：處于水下半深湖沉積環(huán)境，以特小型水下分流河道及席狀砂為主要沉積類型，砂體在平面上多呈窄條狀、串珠狀或透鏡狀分布。河道砂體寬度小于80m，垂向上砂體厚度為0.8～2m。

（4）三角洲外前緣亞相席狀砂沉積模式：水體進一步加深至水下半深湖—深湖沉積環(huán)境，河流攜帶的泥沙被湖浪改造成大片的席狀砂，同時伴隨席內(nèi)緣、席外緣、席間泥，以席狀、片狀、破席狀形態(tài)分布。

3 沉積模式與儲層非均質(zhì)性及剩余油分布關(guān)系

3.1 Ⅰ類儲層

（1）辮狀河由于河道下切，多級韻律變化造成砂體內(nèi)部水平隔層發(fā)育，剩余油在剖面上主要分布于物性相對變差的部位，平面上分布于河道邊部相對薄砂體或局部物性變差的部位。

（2）曲流河剩余油分布受點砂壩非均質(zhì)性控制，側(cè)積體底部局部連通，中上部被泥質(zhì)所分隔，剩余油一般分布在儲層物性變差的厚油層頂部。

3.2 Ⅱ類儲層

水上分流河道及河道帶為高滲帶，分流河道間為低滲帶。廢棄河道和道間泥是控制剩余油分布的關(guān)鍵因素，剩余油多形成于由兩者所形成的注采不完善區(qū)。

3.3 Ⅲ類儲層

河道砂體泥質(zhì)含量高，物性較差，非均質(zhì)性強；加之河道窄小，大面積的席狀砂分布，剩余油主要以井網(wǎng)控制不住型、注采不完善型存在。

4 結(jié)語

（1）綜合研究提出了“封閉骨架剖面控制對比、標(biāo)準(zhǔn)層控制大套地層對比、標(biāo)志層組合對比、特征巖性組合對比、標(biāo)準(zhǔn)層逼近控制對比、沉積模式指導(dǎo)對比”一套河流——三角洲相儲層綜合對比方法，建立全區(qū)等時高分辨率層序地層對比格架。

（2）研究區(qū)識別出2種相6種亞相和19種微相模式，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類儲層共發(fā)育9種沉積模式。

（3）確定了各沉積單元沉積時期的沉積環(huán)境與沉積模式的對應(yīng)關(guān)系。

參考文獻：

[1]鄒才能，池英柳，李明，等.陸相層序地層學(xué)分析技術(shù)——油氣勘探工業(yè)化應(yīng)用指南[M].北京：石油工業(yè)出版社，2004.

[2]趙翰卿，付志國，呂曉光.儲集層層次分析和模式預(yù)測描述法[J].大慶石油地質(zhì)與開發(fā)，2004，23（5）：77

[3]趙翰卿，付志國，呂曉光.大型河流——三角洲沉積儲集層精細(xì)描述方法[J].沉積學(xué)報，2000，21（4）：109-113.

篇3

【摘要】

目的 探討化學(xué)合成小干涉RNA（siRNA）對EpsteinBarr病毒（EBV）潛伏膜蛋白1（LMP1）陽性胃上皮（GT38）細(xì)胞LMP1編碼基因表達的抑制作用，以及對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法 化學(xué)合成靶向LMP1 mRNA不同位點的3對siRNA，分別轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞，選擇干擾效果最佳的siRNA進行實驗研究，行RTPCR、Hochest 33258熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果 RTPCR結(jié)果顯示，3對靶向LMP1的siRNA均能抑制GT38細(xì)胞LMP1的轉(zhuǎn)錄表達，以靶向LMP1 mRNA 649位點的siRNA作用效果最強。Hochest 33258熒光染色可見siRNA649作用后的GT38細(xì)胞發(fā)生凋亡。流式細(xì)胞分析顯示，siRNA649作用24、72以及120 h后的細(xì)胞其細(xì)胞周期無明顯改變。RTPCR檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染siRNA649的靶細(xì)胞Bcl2的表達水平降低。結(jié)論 靶向LMP1的特異性siRNA可以有效抑制LMP1的轉(zhuǎn)錄表達，進而可能通過抑制Bcl2的表達誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。GT38細(xì)胞系可作為研究LMP1生物活性及其在EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生中所起作用的理想的靶細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】 EpsteinBarr病毒 潛伏膜蛋白1 RNA干擾 小干涉RNA 細(xì)胞凋亡

［ABSTRACT］ Objective To explore the relationship between specific silencing effect of siRNA that targets latent membrane protein 1 (LMP1) coding gene on the proliferation and apoptosis of EBV positive gastric epithelium cells. Methods The chemically synthetic siRNA targeting LMP1 was transfected into target cells，then RTPCR， Hochest 33258 staining and flow cytometry were used to detect apoptosis and cell cycle of target cells，respectively. Results RTPCR showed that siRNAs markedly inhibited the expression of LMP1 in target cells，and the effect of siRNA649 was most obvious. Apoptosis was observed in target cells transfected by siRNA649 with Hochest 33258 staining. A flow cytometry analysis showed no obvious discrepancy after 24， 72 and 120 h of transfection of siRNA649. RTPCR showed that siRNA649 inhibited the expression of Bcl2 in target cells. ConclusionChemically synthetic siRNA targeting LMP1 gene could effectively silence the expression of LMP1. Then it may though suppressing the expression of Bcl2 lead target cells apoptosis. This cell line can be used as a good target cell to explore LMP1 bioactivity and its effect in oncogenesis of EBV correlated tumors.

［KEY WORDS］ EpsteinBarr virus; Latent membrane protein 1; RNA interference; siRNA; Apoptosis

EB病毒(EpsteinBarr virus，EBV) 是重要的DNA腫瘤病毒，該病毒與鼻咽癌(NPC)、Burkitt淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[1]。在EBV編碼基因中，潛伏膜蛋白1（LMP1）編碼基因已被確認(rèn)具有癌基因的功能[2]。近年來的研究結(jié)果表明，LMP1具有介導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的功能；LMP1表達還可抑制細(xì)胞分化，與鼻咽癌的低分化有關(guān)，并能促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[3～6]。小干涉RNA（siRNA）能高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型。本研究選擇EBV陽性胃上皮（GT38）細(xì)胞作為靶細(xì)胞，采用人工合成的siRNA特異性阻斷LMP1的表達，檢測LMP1沉默對GT38增殖和凋亡的影響，旨在探討LMP1在EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機制，為EBV相關(guān)腫瘤的生物治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清以及OPTIMEM I培養(yǎng)基均購自美國GIBco公司。LipofectamineTM2000和TRIzol均購自Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司。碘化丙啶(PI)、Hochest 33258購自美國Sigma公司。

1.1.2 靶細(xì)胞 EBV陽性GT38細(xì)胞由日本鳥取大學(xué)醫(yī)學(xué)部生體情報學(xué)教室西連寺剛教授惠贈，用作該實驗的靶細(xì)胞。

1.2 實驗方法

1.2.1 靶向LMP1基因寡核苷酸的設(shè)計 本文靶向LMP1基因的siRNA、熒光標(biāo)記的siRNA（FAMsiRNA）以及非特異性siRNA，均由廣州銳博生物科技有限公司合成。經(jīng)過Blast確定靶向LMP1基因siRNA的特異性及非特異性siRNA與人的mRNA無同源性。序列見表1。

表1 siRNA序列貨號LMP1靶向位點（略）

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染效率的檢測 將GT38細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至30％～50％匯合時，采用脂質(zhì)體法分別以20、30、50、80和100 nmol/L終濃度的FAMsiRNA在OPTIMEM I培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h后，更換為含體積分?jǐn)?shù)為0.10的胎牛血清不含雙抗的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染12 h內(nèi)用倒置熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率=熒光細(xì)胞的數(shù)量/相同視野下的細(xì)胞總數(shù)×100％。靶向LMP1的siRNA和非特異siRNA的轉(zhuǎn)染方法與FAMsiRNA的轉(zhuǎn)染方法相同。

1.2.3 半定量RTPCR檢測LMP1、Bcl2、Bax mRNA轉(zhuǎn)錄水平 將特異性siRNA以50 nmol/L終濃度分別轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h收集細(xì)胞，TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的標(biāo)準(zhǔn)條件合成cDNA用作PCR模板。擴增LMP1、Bcl2、Bax基因和內(nèi)參照基因GAPDH的引物參照文獻[7，8]設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，擴增產(chǎn)物分別為490、318、257和450 bp。PCR擴增產(chǎn)物于含溴化乙錠（0.5 mg/L）的15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。

1.2.4 Hochest 33258染色實驗 將無菌玻片置于6孔板內(nèi)，接種GT38細(xì)胞37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約為40％時，以20和50 nmol/L終濃度siRNA轉(zhuǎn)染，同時設(shè)非特異性對照組及細(xì)胞對照組，置于37 ℃體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出蓋玻片用PBS洗凈，加0.5 mL固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)4 ℃固定5 min，去固定液，用PBS沖洗2次，加終濃度5 mg/L的Hochest 33258避光染色10 min，PBS漂洗后封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞分析 收集轉(zhuǎn)染siRNA后24、72和120 h的GT38細(xì)胞以及細(xì)胞對照，制備單細(xì)胞懸液，PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109/L，加體積分?jǐn)?shù)0.70冷乙醇4 ℃固定24 h以上。PBS洗2次除盡乙醇，300目不銹鋼細(xì)胞篩過濾去除細(xì)胞團塊，加RNase至終濃度0.5 g/L，PI染液至終濃度50 mg/L，暗室孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件，統(tǒng)計處理以3次重復(fù)實驗測定值的±s表示，組間比較用方差分析，P

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染效率的檢測

FAMsiRNA轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞后12 h各濃度組在熒光顯微鏡下均可觀察到細(xì)胞內(nèi)有點狀綠色熒光出現(xiàn)，表明轉(zhuǎn)染成功。隨機計數(shù)5個視野下的細(xì)胞數(shù)量，計算轉(zhuǎn)染效率，取3次實驗的平均值。20、30、50、80和100 nmol/L終濃度siRNA轉(zhuǎn)染效率分別為40.2%、47.9%、90.3%、90.4%和89.7%。表明當(dāng)siRNA終濃度為50、80和100 nmol/L時轉(zhuǎn)染效率較高，因此，實驗中選用50 nmol/L濃度siRNA轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞。

2.2 不同siRNA對LMP1 mRNA轉(zhuǎn)錄表達影響

選用50 nmol/L終濃度siRNA轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后LMP1 mRNA表達量均有不同程度下降，RTPCR檢測結(jié)果見圖1。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組LMP1/GAPDH為0.51±0.03，轉(zhuǎn)染siRNA649組LMP1/GAPDH為0.09±0.00，轉(zhuǎn)染siRNA979組LMP1/GAPDH為0.31±0.02，轉(zhuǎn)染siRNA1348組LMP1/GAPDH為0.43±0.02。與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA的細(xì)胞相比，siRNA649、siRNA979和siRNA1348對靶細(xì)胞LMP1的表達均具有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=235.99，P

2.3 siRNA649對LMP1 mRNA表達影響的時效關(guān)系

選用50 nmol/L終濃度siRNA649轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞，RTPCR檢測LMP1 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達。電泳結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照比較，轉(zhuǎn)染后24、48和72 h對GT38細(xì)胞LMP1的轉(zhuǎn)錄表達均有抑制作用，結(jié)果見圖2。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，siRNA64924 h組LMP1/GAPDH為0.32±0.03，siRNA64948 h組LMP1/GAPDH為0.08±0.02，siRNA64972 h組LMP1/GAPDH為0.15±0.06，GT38細(xì)胞對照組LMP1/GAPDH為0.77±0.09。轉(zhuǎn)染后24、48和72 h時LMP1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均明顯低于細(xì)胞對照組，差異有顯著性（F=89.93，P

2.4 Hochest 33258染色觀察細(xì)胞凋亡

采用Hochest 33258熒光染料對活細(xì)胞進行染色，在波長為365 nm熒光顯微鏡下觀察，可見對照組細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色的橢圓形或圓形，邊界清晰。20和50 nmol/L濃度siRNA649作用48 h后均能觀察到具有典型凋亡特征的GT38細(xì)胞，細(xì)胞核呈亮藍(lán)色的半月形、馬蹄形，邊界清晰，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞染色質(zhì)的邊集、核濃縮或聚集現(xiàn)象；有的細(xì)胞核則呈3個或3個以上的熒光碎塊，結(jié)果見圖3。各組分別隨機計數(shù)200個細(xì)胞，20 nmol/L終濃度轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)較少為20%（40/200），50 nmol/L組凋亡細(xì)胞占30%（60/200）。

2.5 流式細(xì)胞分析

收集50 nmol/L終濃度siRNA649轉(zhuǎn)染后24、72和120 h的細(xì)胞以及細(xì)胞對照，流式分析細(xì)胞周期。參考文獻[9]計算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)：PI=(S+G2)/(G1+S+G2)×100％。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，各組間差異無顯著性（F=5.71，P>0.05），說明本實驗中siRNA649對GT38細(xì)胞的周期無明顯影響。見表2。

表2 各組轉(zhuǎn)染siRNA649后不同時間的PI比較（略）

2.6 siRNA649對Bcl2和Bax mRNA表達影響

選用50 nmol/L終濃度siRNA649轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h時提取各組細(xì)胞總RNA，RTPCR檢測Bcl2、Bax mRNA的轉(zhuǎn)錄表達。電泳結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照比較，轉(zhuǎn)染后24、48和72 h對GT38細(xì)胞Bcl2的轉(zhuǎn)錄表達均有抑制作用，而對Bax的轉(zhuǎn)錄表達無明顯影響，Bcl2/Bax降低。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，GT38細(xì)胞對照組Bcl2/Bax為4.61±1.94，siRNA64924 h組Bcl2/Bax為0.56±0.51，siRNA64948 h組Bcl2/Bax為1.23±0.91，siRNA64972 h組Bcl2/Bax為1.77±1.48。轉(zhuǎn)染后24、48和72 h時Bcl2/Bax mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均明顯低于細(xì)胞對照組（F=5.45，P

3 討論

研究結(jié)果表明，LMP1編碼基因是EBV永生化基因中唯一能夠轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的人和嚙齒類動物細(xì)胞并使之具有致瘤性的基因[10]。除轉(zhuǎn)化B細(xì)胞外，LMP1還可在體外轉(zhuǎn)化哺乳動物纖維母細(xì)胞和人角質(zhì)細(xì)胞，抑制人上皮細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)表皮生長因子受體的表達等，從而表明LMP1在非淋巴細(xì)胞腫瘤的發(fā)病中具有重要作用，是公認(rèn)的EBV致癌基因。LMP1和細(xì)胞信號傳遞密切相關(guān)，研究證實LMP1 可以通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡[11]，參與EBV相關(guān)的腫瘤發(fā)生。因此，如何通過干擾LMP1基因表達以誘導(dǎo)EBV陽性腫瘤細(xì)胞凋亡或降低其惡性程度成為EBV相關(guān)腫瘤研究的熱點。大多數(shù)研究結(jié)果表明，EBV相關(guān)胃癌（EBVaGC）不表達LMP1，只有個別研究在部分EBVaGC組織中檢測到LMP1的表達[12]。本研究選擇的靶細(xì)胞GT38是TAJIMA等[13]于1998年從1名69歲中分化胃腺癌病人的癌旁組織中分離建立的細(xì)胞系，能使SCID小鼠致瘤[14]。該細(xì)胞CD19和CD3分子均為陰性，而細(xì)胞角蛋白陽性，表明其為上皮來源。與大多數(shù)EBVaGC組織中LMP1不表達不同，EBV在GT38細(xì)胞中為Ⅲ型潛伏狀態(tài)，能夠穩(wěn)定地表達LMP1、EBNA1和EBNA2；且GT38細(xì)胞為貼壁生長的上皮細(xì)胞，易采用脂質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)染，實驗操作簡便。

本實驗采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染不同濃度熒光標(biāo)記的陰性對照siRNA以確定轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，各濃度組細(xì)胞內(nèi)均可觀察到綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率在20～50 nmol/L范圍呈濃度依賴性增高，當(dāng)siRNA濃度大于50 nmol/L時轉(zhuǎn)染效率無明顯變化?？紤]到熒光淬滅、進入細(xì)胞siRNA量少等因素，可能還有部分成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未能觀察到熒光，推測實際轉(zhuǎn)染效率應(yīng)高于檢測值，提示脂質(zhì)體適用于人工合成siRNA對GT38細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。 我們根據(jù)LMP1基因的不同區(qū)域，設(shè)計3組不同的siRNA，從而驗證不同的區(qū)域是否對siRNA介導(dǎo)的降解更為敏感，采用RTPCR檢測LMP1的轉(zhuǎn)錄表達來評價沉默效應(yīng)。研究結(jié)果顯示，3對人工合成的siRNA均能特異性沉默LMP1的轉(zhuǎn)錄表達，干擾作用具有特異性，其中以靶序列位于LMP1重要功能區(qū)（第四功能區(qū)內(nèi)）的siRNA 649干擾作用最為明顯，說明針對功能區(qū)設(shè)計的siRNA更能有效地沉默靶基因。轉(zhuǎn)染后24 h即檢測到靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的下降，48 h時siRNA的抑制作用最強，有效阻抑時間可持續(xù)72 h，分析與siRNA降解及細(xì)胞增殖導(dǎo)致siRNA絕對濃度下降有關(guān)。

圖1 不同序列siRNA對LMP1 mRNA轉(zhuǎn)錄表達的影響（略）

①PCR Marker DL2000，②、③轉(zhuǎn)染非特異性siRNA 48 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA表達，④、⑤轉(zhuǎn)染siRNA649 48 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA的表達，⑥、⑦轉(zhuǎn)染siRNA979 48 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA的表達，⑧、⑨轉(zhuǎn)染siRNA1348 48 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA的表達

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA649后不同時間對LMP1 mRNA表達的影響 （略）

①、②轉(zhuǎn)染siRNA649 24 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA的表達，③、④轉(zhuǎn)染siRNA649 48 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA表達，⑤、⑥轉(zhuǎn)染siRNA649 72 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA表達，⑦細(xì)胞對照LMP1 mRNA表達，⑧細(xì)胞對照GAPDH mRNA， ⑨PCR Marker DL2000

圖3 靶細(xì)胞的Hochest 33258染色結(jié)果（略）

A：對照組GT38細(xì)胞，B：50 nmol/L終濃度轉(zhuǎn)染siRNA649后的GT38細(xì)胞(×400)

圖4 轉(zhuǎn)染siRNA649后不同時間Bcl2、Bax mRNA 表達變化（略）

①PCR Marker DL2000， ②GT38細(xì)胞對照中Bcl2 mRNA的表達，③～⑤分別為轉(zhuǎn)染siRNA649 24、48、72 h后Bcl2 mRNA的表達，⑥GT38細(xì)胞對照中GAPDH mRNA表達， ⑦～⑨分別為轉(zhuǎn)染siRNA649 24、48、72 h后GAPDH mRNA的表達，⑩GT38細(xì)胞對照中Bax mRNA的表達，～轉(zhuǎn)染siRNA649 24、48、72 h后Bax mRNA的表達

細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為3期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱ期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅲ期的細(xì)胞核裂解為碎塊，形成凋亡小體。在轉(zhuǎn)染特異性siRNA的細(xì)胞中同時存在這3期表現(xiàn)，而對照組細(xì)胞染色均勻，表明siRNA可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

典型的細(xì)胞周期包括有嚴(yán)格順序的4個期，即G1期(DNA合成前期)S期(DNA合成期)G2期(DNA合成后期)M期(分裂期)；細(xì)胞的DNA合成和有絲分裂期是細(xì)胞增殖的兩個重要指標(biāo)，兩者之和稱為增殖指數(shù)。G1S期的調(diào)控點稱“啟動點”或限制點，位于G1期末，DNA合成的起始。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的細(xì)胞周期缺陷主要發(fā)生在細(xì)胞周期限制點及G1期DNA損傷檢查點，尤其以G1S的調(diào)控更為重要[15]。本研究結(jié)果顯示，siRNA649作用不同時間后的細(xì)胞增殖指數(shù)無明顯改變，原因可能是各期細(xì)胞的多少只代表細(xì)胞停留在這一時相的時間長短，并不真正代表進入細(xì)胞增殖周期的細(xì)胞數(shù)量。因此，LMP1基因沉默對GT38細(xì)胞周期的影響仍需進一步探討。LMP1能夠介導(dǎo)功能不同甚至功能相反的基因表達，LMP1介導(dǎo)的基因表達與其表達持續(xù)時間和表達水平相關(guān)，不同表達水平和不同表達時間介導(dǎo)的基因表達譜不同；在不同細(xì)胞、不同條件下，LMP1具有促進細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞凋亡的雙重生物學(xué)效應(yīng)[16]。有研究結(jié)果表明，LMP1表達可通過上調(diào)Bcl2的作用而抑制人B淋巴細(xì)胞的凋亡[17]。劉克拉等[18]的研究則顯示，人鼻咽癌組織中的LMP1與Bcl2的表達無相關(guān)性，Bcl2的表達也不能抑制鼻咽癌細(xì)胞凋亡。另有研究顯示，多數(shù)組織表達少量的Bcl2，其表達水平在不同的細(xì)胞及組織不同。例如，在皮膚和黏膜組織中，基底細(xì)胞和黏膜干細(xì)胞表達Bcl2，而位于表面的細(xì)胞極少甚至不表達；結(jié)直腸黏膜在生理范圍內(nèi)表達高水平的Bcl2，但胃黏膜幾乎檢測不到Bcl2的表達。

Bcl2和Bax同屬于Bcl2蛋白家族，分別具有抑制和促進細(xì)胞凋亡功能，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。分布于線粒體外膜上的Bcl2蛋白通過穩(wěn)定線粒體膜，防止線粒體內(nèi)促凋亡相關(guān)蛋白泄漏至胞質(zhì)及阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，使依賴Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低等途徑阻斷細(xì)胞凋亡[19]。Bax是Bcl2基因家族中的細(xì)胞凋亡促進基因，具有抑制Bcl2、進而促進細(xì)胞凋亡的作用。目前認(rèn)為 Bax和Bcl2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡：當(dāng)Bax形成同源二聚體時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bax與Bcl2形成異源二聚體時則抑制細(xì)胞凋亡。本研究表明，在具有惡性性質(zhì)的胃上皮細(xì)胞GT38中Bcl2基因在mRNA水平呈陽性表達；干擾LMP1后，對GT38細(xì)胞Bcl2的轉(zhuǎn)錄表達有抑制作用，而對Bax的轉(zhuǎn)錄表達無明顯影響，Bcl2/Bax降低。推測本實驗干擾LMP1后，Bcl2表達下調(diào)，Bax蛋白占優(yōu)勢，發(fā)生構(gòu)象改變，形成同源二聚體，進而活化凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

腫瘤細(xì)胞中EBV主要以潛伏感染的形式存在，根據(jù)其潛伏期基因的表達情況，分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型潛伏，LMP1為EBVⅡ型和Ⅲ型潛伏時表達的病毒基因。EBV的Ⅲ型潛伏通常見于體外EBV永生化的B淋巴母細(xì)胞系和某些免疫缺陷病人的B淋巴細(xì)胞增生性疾病，該類細(xì)胞系多呈懸浮生長，不適合用脂質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)染；而EBVⅡ型潛伏的細(xì)胞系多見于鼻咽癌細(xì)胞系。我們首次采用LMP1穩(wěn)定表達的具有惡性性質(zhì)的胃上皮細(xì)胞進行實驗研究，結(jié)果顯示人工合成的siRNA可有效沉默靶細(xì)胞LMP1的轉(zhuǎn)錄表達，進而引起某些細(xì)胞表型的改變，表明GT38細(xì)胞可用作深入探討LMP1生物學(xué)功能的理想靶細(xì)胞。此外，鑒于大多數(shù)EBVaGC組織不表達LMP1，該細(xì)胞系對進一步闡明LMP1在EBVaGC發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。

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篇4

我愿化作一只飛燕，率先登上頂峰去尋找金銀銅牌的蹤跡。

我愿化作一只飛燕，來體會那剎那“一覽眾山小”的輝煌。

南山，我的高中。

在這么一個匯聚著四川各地英才的地方，我發(fā)覺我是如沙粒般如此微不足道，一個個精英才子在我身邊閃現(xiàn)，仿佛我這顆黯然的連名字都叫不出來的小星是為了襯托他們的輝煌而存在。

每一年，南山中學(xué)全國奧數(shù)第一，第二層出不窮，甚至讓人有了一種理所當(dāng)然的感覺，而我啦，每當(dāng)看到學(xué)校光榮榜上的名字，照片，心中除了自卑就只剩下失落。

因為，我連普通數(shù)學(xué)考試也一直掛科。

這對我來說，實實在在是個諷刺，同樣的學(xué)校，看著同樣的花草樹木，呼吸著同樣的空氣。為什么，這差距竟讓我有了一種望塵莫及的感覺？

可悲，可笑。

是什么造成了如此的天壤之別？

習(xí)慣，是習(xí)慣。

一切的事物都以習(xí)慣為自然，沒有一個好的習(xí)慣，即使你是比愛因斯坦還天才的人，你的天賦也只會是曇花一現(xiàn)，而最后被無數(shù)個不是天才，卻擁有好習(xí)慣的人，甩在后面。

數(shù)數(shù)指頭，2012年也已經(jīng)不遠(yuǎn)了，這意味著什么？意味著我的機會來了，上帝網(wǎng)開一面給了我重新來過的機會，我難道會任由他錯過。

不，不會。

2012年，等著我，我會以良好的習(xí)慣為開端，去征服這一年，去嘗試觸摸那些如今我只能仰視的東西。

也許你不相信，但是365天之后，你一定會發(fā)現(xiàn)，我已經(jīng)化作一只飛燕，飛在你上空。

篇5

微笑不難　 但是　 以微笑面對一切　 就很難　 當(dāng)人生孤獨時　 你能微笑嗎？　 但是用微笑面對　 是再好不過的了

世界上有三種紅塵：　 心　 朋友　 世界

當(dāng)你學(xué)會用微笑面對一切時　 你就看透了這三種紅塵　 心里的紅塵　 是人們最為遙遠(yuǎn)的地方　 當(dāng)心碎了　 你能以微笑面對一切嗎　 我能　 心碎了　 你如果你不以微笑面對　 你會減輕你的痛苦嗎　 心里的紅塵　 對于有些人來說　 是望塵莫及的　 但是　 以微笑面對一切　 是萬物之根本　 用微笑來掩飾自己的痛苦　 是最好的抉擇

心之苦　 誰能懂　 你們懂嗎　 心　 有多苦　 只有自己明白

篇6

尊敬的人類：?

首先，對萬物之主的智慧生物致以崇高的敬意。?

自開天地，萬物形成，眾生平等，自由生活。然而無能鼠輩不能以正道生存，做起了偷摸東西、損人利己的勾當(dāng)，霸占糧食，損毀衣物，擾亂人們正常的生活，甚至傳播疾病，犯下滔天大罪。自帝嚳開始，鼠類便為人類之大敵。出于正義之感、自然之法，自然界生靈們對鼠輩表示譴責(zé)，并推舉貓頭鷹、蛇、黃鼠狼等作為鼠之天敵，組成滅鼠聯(lián)盟。千萬年來，我們兢兢業(yè)業(yè)，牢記使命，為自然、為人類除去鼠患，竭力保持生態(tài)平衡，為構(gòu)建和諧自然傾盡全力。?

可是，正當(dāng)我們認(rèn)真履行自身職責(zé)時，你們?nèi)祟悈s忘卻了自然之法，大肆殺害滅鼠聯(lián)盟之戰(zhàn)士，導(dǎo)致我們成員數(shù)目日益減少，元氣大傷。這一切，只因你們?nèi)祟愄澙?，熱衷野味，視我們?yōu)椴妥郎系募央?，完全不顧我們?yōu)槿祟愖鞒龅木薮筘暙I！唉，你們只顧眼前，不看長遠(yuǎn)，結(jié)果呢，鼠患日益嚴(yán)重，各地鼠輩橫行。公元2007年，洞庭湖一場洪水，20億田鼠遷徙，所過之處，農(nóng)田幾無收獲，田間地頭一片狼藉。人類啊，當(dāng)你動輒用大量人力物力，甚至派出飛機滅鼠時，可曾想過，之所以會釀成今日鼠災(zāi)苦果，是因為當(dāng)初自己的貪婪！?

自古君子“酌貪泉而覺爽，處涸轍以猶歡”。人不可貪婪，應(yīng)坦誠對待萬物，即使擁有我們望塵莫及的偉大智慧，即使建立城市，登上月球，都不可忘卻自然法則，冷落心中那片回歸自然、感受生命的純潔土地。“憂勞可以興國，逸豫可以亡身”，要是人類沉浸于取得文明的巨大成就中而不思自省，那么千年前樓蘭古城的冤魂們冥冥中也要扼腕長嘆了！?

如今的滅鼠聯(lián)盟已是支離破碎，殘破不堪，我等捕鼠志士，面對猖狂鼠輩，心中悲憤不已。但是我們縱使面對千萬災(zāi)難，也會堅強地站起來；我們更期待人類能改過自新，牢記教訓(xùn)，遵守自然法則，努力構(gòu)建新社會新自然。我們相信，現(xiàn)代科技掩蓋不了心中那種親近土地的自然感情，我們相信，貪婪的欲望戰(zhàn)勝不了心中那種純真質(zhì)樸的土壤氣息。?

人類啊，請你們安靜一會兒，聆聽藏在心里已久的自然之心，感受一下自然之情。愿我們能夠一起通過努力，構(gòu)建一個和諧的、詩意的、全新的美好自然！?

敬禮！?

滅鼠聯(lián)盟?

2008年6月8日?

篇7

雖然這世界有很多不公平,雖然這世界有很多不快樂,雖然這世界充滿了悲傷和離別.

一個人做事有輸也有嬴,輸了的你也許會認(rèn)為上帝創(chuàng)造了你,卻永遠(yuǎn)看不見你,只是偏愛那些優(yōu)秀的人.你永遠(yuǎn)也成不了上帝捧在手心里的寵兒.也許你會認(rèn)為上帝只賦予了那些天資聰明的人幸福的堤岸,而你卻對那種生活望塵莫及,甚至覺得自己永遠(yuǎn)比不上別人.也許你是那個寵兒,當(dāng)你用輕掠的目光看著別人的時候,別人怎么想?

我仰天長問:上帝你你難道望了那些不優(yōu)秀的人了嗎?

直到某日,并不是寵兒的人不在悲傷了.因為明天會更好!是金子總有發(fā)光的時候.

我深信:世界沒有偏愛,只要你努力的去做,我們都是天使!

篇8

1、追溯英語的發(fā)展，我們通常將它分為三個時期：古英語時期、中古英語時期、近代英語時期。

2、英語，作為當(dāng)今世界歷史上的國際社交語言，它取得的成功是史無前例的。從使用它的人口來說，以英語為母語的人數(shù)僅次于漢語而居世界第二位，大約有四億多人。然而以英語作為第二語言、或者在一定程度上使用英語的人數(shù)，要遠(yuǎn)比這多得多，可以說分布在世界的各個角落、各個民族，在這一點上漢語是望塵莫及的。

（來源：文章屋網(wǎng) ）

篇9

很成功的晚會。

以天作幕，以地作臺，絢麗的色彩，無窮的變化......連宇宙第一強國都會望塵莫及,卻是在人均收入很低的中國。

朝鮮的金胖子今晚自然無法入睡了----中國的表演已經(jīng)超越他們了.

儼然盛世。以煙花、燈光、胭脂和馬屁堆砌出來的盛世。

老謀子不愧為魔術(shù)大師，但和他的電影一樣，在絢目之后，只剩下空洞。

中國的當(dāng)務(wù)之急是什么？是已成水火的官民矛盾。

腐朽的體制，是好人變壞的魔術(shù)箱。

官員財產(chǎn)公示，是萬里的第一步。

今晚的TAM廣場，全是臭屁。

唯一值得表揚的，攝影和導(dǎo)播比奧運會強了很多。

篇10

她，圓圓的腦袋，嘴角向上微微翹起，估計是在烈日暴曬下而變得黝黑的皮膚。別看她一幅不正經(jīng)的樣子，在翻筋斗方面，可是令人望塵莫及的哦！

就說那次吧，我們?nèi)コ缛宕河?。大概是春意盎然的緣故吧，那充滿無限生機的美麗公園頓時便成了她的舞臺。一下，兩下，三下……只見她雙手撐著地面，腰部稍微彎曲，就這么利索地翻過了第一下，之后便是借著這股慣性，雙手不停地交換著，又翻過了幾下。最后，她單手直撐著地面，身體與地面成45度角傾斜，左手突然抽離地面，右手在即將倒下時再次撐住地面，借著這股往前沖的勁兒，她成功完成了最后一次的翻躍。頓時，掌聲如同暴雨一般向她襲來。

俞日輝不服氣，向她提出挑戰(zhàn)，結(jié)果可想而知。彥君都翻出了五六個了，他才翻了一兩個，這還不算，他還一屁股坐在了草坪上，起不來了呢！

楊彥君，你不愧是“筋斗云”，你真是名符其實??！

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